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聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(poly(ADP-ribose)polymerase1，PARP1）是参与DNA单链断裂(single strand break，SSB)损伤碱基切除修复(base excision repair,BER)的关键修复酶。针对PARP1开发的靶向抑制剂奥拉帕尼(olaparib，AZD2281)、卢卡帕尼(rucaparib，AG014699)和尼拉帕尼(niraparib，MK-4827)已先后在美国/欧洲获批上市，用于同源重组(homologous recombination，HR)修复缺陷、特别是乳腺癌易感基因1/2(Breast Cancer susceptibility gene1/2，BRCA1/2)缺陷的卵巢癌和/或乳腺癌的治疗。尽管PARP1抑制剂已成功用于BRCA1/2突变卵巢癌和乳腺癌的临床治疗，但仍有许多问题尚未解决，例如PARP1抑制剂的耐药性问题。 与其他抗肿瘤药物一样，PARP1抑制剂的长期使用，将会导致肿瘤产生耐药性。随着PARP1抑制剂在临床上应用的日益增加，了解其耐药特性、耐药机制变得越来越紧迫，因为这是如何预防和应对其耐药性的基础和前提。目前关于PARP1抑制剂耐药的机制主要包括靶点PARP1的改变、同源重组基因BRCA1/2的回复突变、53BP1的缺失以及药物外排转运体的过表达等，但上述已知的PARP1抑制剂耐药机制均来源于对BRCA1/2缺陷肿瘤的相关研究。然而，除BRCA1/2之外的其他参与HR修复的修复因子的突变/缺失，也会影响肿瘤对PARP1抑制剂的反应性，例如，PTEN的缺陷。作为肿瘤抑癌基因，PTEN在多种类型癌症中均可发生突变，神经胶质瘤的PTEN缺陷频率高达70％。但是，迄今为止，还没有关于PTEN缺陷肿瘤对PARP1抑制剂的耐药特性和耐药机制的相关报道。 为此，本研究选用PTEN缺陷的入神经胶质瘤U251细胞，三种处于不同临床开发阶段、具有不同特性的PARP1抑制剂奥拉帕尼（首个获批上市的PARP1抑制剂），他拉唑帕利(talazoparib;目前已知最强效的PARP1抑制剂、正在进行Ⅲ期临床试验）和希明哌瑞（simmiparib;我所自主研发的PARP1抑制剂、正在进行Ⅰ期临床试验），采用逐渐增加药物浓度的方式，建立了3种相应的耐药细胞，分别命名为U251/OP、U251/TP和U251/SP。在此基础上，不但考察了建株用PARP1抑制剂的耐药特性，而且还考察了非建株用PARP1抑制剂及13种临床常用细胞毒类抗肿瘤药物的交叉耐药性;进一步研究了耐药细胞的生长速度、迁移能力和侵袭能力等肿瘤生物学特性的变化情况;随后对PTEN缺陷U251耐药细胞可能耐药机制进行了较系统的研究，包括对靶点PARP1变化的影响、PTEN回复突变情况、药物外排转运体如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表达水平的影响、对DNA修复通路、修复因子水平与功能的影响等;最后，对PARP1抑制剂耐药生物标志物进行了探究，发现脱氧核糖核苷酸(deoxynucleoside triphosphate，dNTP)三磷酸水解酶SAMHD1(Sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain-containing protein1)可以作为PARP1抑制剂耐药的潜在生物标志物。 本研究建立PTEN缺陷U251细胞的PARP1抑制剂耐药株U251/OP、U251/TP和U251/SP，奥拉帕尼、他拉唑帕利和希明哌瑞的起始浓度分别为5μM、0.5μM和0.1μM，然后逐渐增加药物浓度至终浓度40μM、2μM和2μM;相应药物处理时间为112天、117天和88天。建立的耐药细胞U251/OP、U251/TP和U251/SP对各自的诱建药物奥拉帕尼、他拉唑帕利和希明哌瑞的耐药程度分别为10.07倍、24.62倍和30.05倍。各耐药细胞的耐药性稳定，不需要加药维持即可持续耐药。与亲本细胞相比，耐药细胞的生长速度、迁移运动能力和侵袭能力无显著性改变。 所建三株耐药细胞对非建株用PARP1抑制剂显示一致性的耐药性。三株耐药细胞对PARP1抑制剂奥拉帕尼、他拉唑帕利、希明哌瑞、尼拉帕尼和卢卡帕尼均显示交叉耐药，耐药倍数分别为8.32倍～9.85倍，6.37倍～27.28倍，51.09倍～71.78倍，7.38倍～14.72倍和2.46倍～4.35倍。U251/OP细胞、U251/TP细胞和U251/SP细胞对13种细胞毒类药物则显示出差异的交叉耐药性:均对阿糖胞苷(Ara-C)具有一致且较高水平的交叉耐药，耐药倍数在6.80倍～7.07倍之间;虽然U251/OP对5-氟尿嘧啶和紫杉醇、U251/SP对吉西他滨和紫杉醇的耐药程度达3倍以上，但是U251/TP对上述三种抗肿瘤药物几乎没有耐药性;此外，三株耐药细胞对包括顺铂在内的其他受试细胞毒类药物均无显著交叉耐药性，耐药倍数均小于2倍。该结果表明，PTEN缺陷U251细胞的PARP1抑制剂耐药细胞对细胞毒类抗肿瘤药物呈现出独特的交叉耐药谱。 本研究发现，靶点PARP1、PTEN突变和药物外排转运体P-gp均未参与U251/OP细胞、U251/TP细胞和U251/SP细胞的耐药。与亲本U251细胞相比，耐药细胞在PARP1抑制剂处理后，产生DNA双链断裂（标志物γH2AX）和G2/M期阻滞均显著减少，提示PARP1抑制剂耐药细胞的DNA损伤应答通路发生了改变。进一步研究发现，DNA损伤应答蛋白53BP1在三株耐药细胞中一致性表达降低;而且，外源性过表达53BP1恢复耐药细胞对PARP1抑制剂的敏感性达到76％。该结果表明，53BP1的表达下调是U251/OP细胞、U251/TP细胞和U251/SP细胞对PARP1抑制剂耐药的重要共同分子机制。 脱氧核糖核苷酸三磷酸水解酶SAMHD1被认为是急性髓性白血病对阿糖胞苷耐药的分子标志物之一。基因表达谱结果显示，在U251/OP细胞、U251/TP细胞和U251/SP细胞中SAMHD1均显著高表达;该结果进一步被qPCR、Western Blot和免疫荧光的结果所确证。采用CRISPR/Cas9技术敲除SAMHD1能够完全逆转耐药细胞对阿糖胞苷的耐药性，然而却不能够恢复其对PARP1抑制剂的敏感性。虽然如此，由于SAMHD1在三株耐药细胞中一致性稳定持续的高表达，提示其可以作为U251细胞对PARP1抑制剂耐药的潜在生物标志物。 综上，本研究首次针对PTEN缺陷的人肿瘤细胞，建立了三种PARP1抑制剂奥拉帕尼、他拉唑帕利和希明哌瑞的耐药细胞U251/OP、U251/TP和U251/SP，并阐明其对PARP1抑制剂一致性、不可逆的耐药特性和对临床常用细胞毒类抗肿瘤药物独特的交叉耐药性;揭示了53BP1的表达下调是PTEN缺陷的三种人肿瘤细胞对PARP1抑制剂耐药的重要、共同分子机制;首次发现脱氧核糖核苷酸三磷酸水解酶SAMHD1可以作为U251细胞对PARP1抑制剂耐药的潜在生物标志物。这些发现丰富了对PARP1抑制剂获得性耐药及其机制的认识，为临床有效防治PARP1抑制剂耐药肿瘤奠定了基础。