论文部分内容阅读
研究背景食管癌是我国发病率较高、预后不良的消化道肿瘤之一。研究发现肿瘤新生血管系统的形成是恶性肿瘤复发、转移的重要因素之一,当肿瘤体积超过2mm3时,要维持其生长则需要形成血管形成拟态(VM)和新生内皮血管来维持肿瘤组织的血液供应[1]。有研究[2-5]表明,在多种实体肿瘤组织如恶性胶质瘤、侵袭性卵巢癌、喉头鳞状细胞癌、炎性乳癌等中发现VM的存在,提示恶性肿瘤组织中普遍存在着VM并且具有重要意义。而有研究表明在VM形成过程中起到关键作用的分子信号通路为磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)信号通路。PI3K及其下游MMPs家族可以调控血管拟态的形成,与肿瘤细胞的增殖、迁移等密切相关[6-8]。全反式维甲酸(ATRA)作为重要的诱导分化剂已经成功应用于临床,尤其是在急性早幼粒细胞白血病治疗当中发挥重要作用。有研究[9,10],发现ATRA能够抑制食管癌细胞的增殖、迁移,可能与抑制VEGF相关肿瘤血管生成有关。而维持肿瘤血供不仅依靠新生血管,血管形成拟态也起着重要作用,但其作用的相关细胞因子及信号通路还不明确,可能存在多条信号通路或多个靶点。本研究通过ATRA及PI3K抑制剂LY294002作用于体外培养的食管癌EC1细胞系,观察药物对细胞的增殖、迁移以及PI3K、MMP-2 m RNA和蛋白表达的影响,探索ATRA、LY294002单药或联合作用是否能够抑制食管癌细胞血管形成拟态,为食管癌抗血管治疗方面提供理论依据。目的探讨全反式维甲酸(ATRA)、磷脂酰肌醇激酶-3抑制剂LY294002单独或联合作用对食管癌EC1细胞增殖、迁移及PI3K和MMP-2表达的影响。方法将常规培养的EC1细胞随机分为ATRA组、LY294002组、ATRA+LY294002组和对照组4组,采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况,采用划痕实验测定各组细胞的迁移能力,采用RT-PCR和Western blot实验方法检测各组细胞中PI3K及MMP-2 m RNA和蛋白的表达情况。结果1.CCK-8结果:作用于24h后,实验组即ATRA组(ATRA终浓度10μmol/L)、LY294002组(LY294002终浓度30μmol/L)和ATRA+LY294002组(ATRA终浓度10μmol/L、LY294002终浓度30μmol/L)的细胞增殖抑制率分别为(45.81±1.25)%、(46.79±0.93)%及(53.10±0.87)%;48h后,各实验组的细胞增殖抑制率分别为(52.76±1.17)%、(55.29±2.24)%及(65.55±2.50)%;72h后,各实验组的细胞增殖抑制率分别为(66.77±1.10)%、(70.26±2.35)%及(84.24±2.38)%。而对照组三个时间点的抑制率均为0.00%。经统计学分析,各实验组分别与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),且两药联合组与单药组相比,差异也具有统计学意义(P<0.05)。2.划痕实验结果:各组细胞划痕后培养24h,实验组3组中细胞迁移率分别为(50.43±1.36)%,(50.36±0.79)%及(24.63±1.74)%;对照组细胞迁移率为(74.50±1.06)%。0h各组细胞的迁移率均为0.00%。各实验组分别与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05),且两药联合组与单药组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、RT-PCR结果:各组细胞培养48h后,实验组3组中PI3K m RNA的相对表达量分别为(25.45±3.45)×10-2、(24.08±1.48)×10-2及(12.45±1.77)×10-2,对照组为(46.48±0.78)×10-2;实验组3组中MMP-2 m RNA的相对表达量依次为(20.39±1.97)×10-2、(19.78±4.17)×10-2及(9.74±2.25)×10-2,对照组为(38.09±1.81)×10-2。可以看出,实验组两指标表达量均低于对照组,且两药联合组更明显。经统计学分析,各实验组分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且两药联合组与各单药组比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。4、Western blot结果:分组并加入药物后培养48h,实验组3组中PI3K蛋白相对表达量分别为(54.08±0.97)×10-2、(53.94±2.21)×10-2及(25.08±0.58)×10-2,对照组为(72.53±1.42)×10-2;实验组3组中MMP-2蛋白相对表达量依次为(43.07±1.08)×10-2、(39.78±0.36)×10-2及(20.48±0.56)×10-2,对照组为(58.43±0.49)×10-2。结果表明,与对照组相比,药物作用EC1细胞48h后PI3K及MMP-2蛋白表达量均降低,经统计分析,各实验组分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),两药联合组与单药组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1、全反式维甲酸和PI3K抑制剂LY294002对食管癌EC1细胞的增殖均具有抑制作用,并伴随作用时间的延长,抑制作用越显著,且两药联合组较单药组抑制作用更明显。2、全反式维甲酸和LY294002均可以抑制EC1细胞的迁移,抑制PI3K及MMP-2 m RNA和蛋白的表达,并且两药联合作用较单药作用更显著。3、全反式维甲酸和LY294002均能够抑制EC1细胞的增殖和迁移,可能与下调PI3K及MMP-2 m RNA和蛋白表达有关,两者联合下调PI3K和MMP-2的作用较单药明显,表明两药协同抑制PI3K信号通路,进而抑制肿瘤血管形成拟态。