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目的:1.探讨负性共刺激分子LAG3与PD-1在乳腺癌患者T细胞中共表达的特点。2.分析LAG3与PD-1共表达时对T细胞功能的影响。3.探讨LAG3与PD-1不同阻断治疗策略对乳腺癌发展的影响。方法:1.根据纳入和排除标准,临床入组乳腺癌患者,收集其外周血及肿瘤组织,流式细胞技术分析患者外周血、肿瘤浸润性、癌旁组织中T细胞LAG3与PD-1共表达的特点,并根据临床分期和分子分型进行分层分析其二者的共表达特点;2.通过CFSE染色、BrdU掺入及ELISA法分别检测LAG3与PD-1不同表达对T细胞增值与分泌功能的影响;3.免疫组化法分析乳腺癌组织、癌旁组织中LAG3与PD-1的主要配体MHCⅡ类分子、FGL1和PD-L1的表达情况,并比较它们在不同临床分期与分子分型乳腺癌中的差异性;4.通过EMT6和E0771小鼠乳腺癌建模,分别进行LAG3、PD-1的单一或联合单克隆抗体阻断治疗,观察小鼠肿瘤的生长情况,从而反向验证LAG3与PD-1共表达对乳腺癌发展的影响。结果:1.经过知情同意、纳入和排除标准筛选后,共入组乳腺癌患者112例,其中收集外周血标本82例,癌组织及癌旁组织标本47例,健康对照者18例,三组在年龄上没有显著差异性(P>0.05)。2.不同临床分期患者的外周血淋巴细胞(PBL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和癌旁组织淋巴细胞(PIL)中LAG3与PD-1双阳性T淋巴细胞百分比没有显著差异性(P>0.05);不同临床分期患者的PIL和TIL中,LAG3和PD-1双阳CD8~+T细胞的百分比均高于其双阳性的CD4~+T细胞(P<0.05)。3.不同分子分型乳腺癌患者的PBL、PIL和TIL中LAG3与PD-1双阳性T淋巴细胞的百分比具有显著差异性(P<0.01),其在三阴性乳腺癌组(TN)中的比例最高,而在雌激素/孕激素受体阳性组(ER~+/PR~+)中的比例最低(P<0.01)。相同分子分型中,LAG3和PD-1双阳CD8~+T细胞的百分比均高于其双阳性的CD4~+T细胞(P<0.05)。4.通过CFSE染色和BrdU掺入法检测均发现,LAG3与PD-1双阳性T细胞经刺激后发生增殖的比例最低,约80%的细胞仍处于原代未分裂状态,LAG3与PD-1双阴性T细胞增殖最活跃,仅10%左右处于未分裂状态,而LAG3与PD-1单一阳性T细胞均有约50%的细胞处于未分裂状态。以上结果提示不同表型T细胞增殖能力具有明显的差异性(P<0.01)。5.ELISA法检测不同表型T细胞的细胞因子分泌能力。LAG3与PD-1双阳性T细胞经过刺激后,其CD4~+T细胞分泌的IL-2、IL-6水平和CD8~+T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α水平,均显著低于其LAG3或PD-1单一阳性T细胞(P<0.01),也更显著低于其LAG3与PD-1双阴性的T细胞(P<0.001)。6.免疫组化分析发现,LAG3的配体MHC II类分子和FGL1,以及PD-1的配体PD-L1,它们在癌组织和癌旁组织中的表达均具有差异性(P<0.05)。MHC II类分子在癌旁组织中表达阳性率高于癌旁组织(P<0.05),而FGL1和PD-L1在癌旁组织中表达阳性率均低于癌组织(P<0.05)。7.在乳腺癌组织中,MHC II类分子、FGL1和PD-L1的表达率在不同临床分期中存在差异性,它们各自在I期和II期之间均没有统计学差异(P>0.05),但它们与III期比较均存在显著差异性(P<0.05)。8.在乳腺癌组织中,MHC II类分子、FGL1和PD-L1的表达率在不同分子类型肿瘤中也存在差异性(P<0.05)。除MHC II类分子外,FGL1和PD-L1的表达率在三阴性乳腺癌中最高(P<0.05)。9.在三阴性乳腺癌小鼠模型中,使用anti-PD-1和anti-LAG3联合阻断治疗组小鼠肿瘤的体积和重量均明显小于anti-PD-1或anti-LAG3单独阻断治疗组(P<0.05),更明显小于对照组(P<0.05)。结论:1.乳腺癌中LAG3与PD-1双阳性T淋巴细胞比例呈现出由外周血到癌旁组织再到肿瘤组织中逐渐升高的趋势,其在外周血中没有差异性,而在癌组织和癌旁组织中存在差异性,并与分子分型有关,三阴乳腺癌中比例最高,ER~+/PR~+乳腺癌中最低。2.LAG3与PD-1双阳性T细胞相较二者单阳性T细胞功能明显耗竭,二者呈现出协同抑制效应。3.LAG3与PD-1的配体FGL1和PD-L1在不同临床分期和分子分型癌组织的表达率存在差异性,总体呈现分期越晚,其表达率越高;而在不同分子分型中,其表达率在三阴性乳腺癌中最高,而在ER~+/PR~+乳腺癌中最低。4.对于三阴性乳腺癌,联合使用anti-LAG3和anti-PD-1的治疗效果优于单独使用二者的治疗效果,提示LAG3与PD-1的联合阻断治疗有望成为三阴性乳腺癌重要的治疗策略。