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研究背景肾损伤分子-1(Kidney Injury Molecular-1, KIM-1),也被称为T细胞免疫球蛋白及粘蛋白1(T cell Ig and Mucin-1,TIM-1)或A型肝炎病毒的细胞受体-1(A virus cellular receptor-1,Havcr-1)是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白基因超家族。KIM-1在正常肾组织中检测不到,而在急性受损后的近曲小管上皮细胞顶端表面显著表达。作为一个非髓性磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)的受体,KIM-1胞外域能结合并内化氧化的脂质体,以及管腔凋亡细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸。通过这种方式,KIM-1能辅助清除管腔中的细胞碎片,促进肾小管的修复与组织再造。近年来研究表明,KIM-1也在多种慢性肾脏病的动物模型表达上调,包括蛋白质过载肾病,阿霉素肾病,血管紧张素Ⅱ诱导的肾损伤和小鼠多囊肾,其表达与纤维化和炎症区域重叠。在人类慢性肾脏病中,KIM-1表达上调与人类同种异体移植肾间质纤维化直接相关。在急性肾损伤(Acute Kidney Injury, AKI)及其衍发地慢性肾脏疾病(Chronic Kidney Disease, CKD)中KIM-1表达与炎症和纤维化区域高度重叠,其流行病学关联研究表明,KIM-1可能在连接急性肾损伤向慢性肾病和肾纤维化演变中发挥重要作用。同样,在肾组织特异性过表达KIM-1的转基因小鼠出现肾小管损害,肾单位减少数量,纤维化,高死亡率和心肌肥厚。KIM-1能迅速、灵敏、特异地反映各种肾脏疾病的损伤及恢复过程,已成为一种检测早期肾损伤的可靠生物学标记物在临床上广泛应用,然而其在肾脏疾病中发生发展中的病理生理作用仍然不是很明确。斑马鱼(zebrafish),热带淡水鱼的一种,已经成为一个好的脊椎动物模型,应用于人类疾病,遗传学和生长发育的研究。大约70%的人类疾病基因,在结构和功能上与斑马鱼高度同源。由于斑马鱼的肾脏结构比较简单,包括幼虫时期的前肾及成鱼时期发展的中肾,斑马鱼已成为一种非常流行的研究模型,用于急性肾损伤,多囊肾(Polycystic Kidney Disease, PKD),肾小球肾炎和一系列小管纤毛疾病的研究。同时,斑马鱼繁殖发育迅速,易于基因改造及其光学透明性,使其成为探讨及研究KIM-1介导的急性和慢性肾脏改变的理想模型。在这项研究中,通过使用基因组及生物进化分析,我们发现并证明了斑马鱼Kim-1基因家族由zKim-1, zKim-3和zKim-4组成。zKim-1的结构和功能与哺乳动物KIM-1高度同源。通过创建肾小管上皮细胞特异性过表达Kim-1斑马鱼模型及Cre介导地可调节性肾小管上皮细胞特异性过表达Kim-1斑马鱼模型,我们证实持续性过表达KIM-1在肾小管上皮细胞中的病理生理作用。第一章zKim家族基因序列对比及zKim-1剪接变体鉴定目的在斑马鱼全基因组中寻找Kim家族系列基因,探讨Kim家族系列基因在斑马鱼基因组中的分布情况,为Kim-1蛋白的转基因斑马鱼奠定分子基础。方法在多种公共蛋白及cDNA数据库中搜索Kim家族基因序列,如Ensembl人类基因组浏览器(Ensembl Genome Browser, http://useast.ensembl.org/Daniorerio/Info/Index) GenBank,美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)以及UCSC基因组浏览器(UCSC Genome Browser, http://genome.ucsc.edu)等。采用不同的同源性基因比对程序,筛选与人类及哺乳动物的KIM家族基因序列同源相似性程度较高的斑马鱼KIM家族基因序列。通过cDNA基因序列,蛋白质编码序列及蛋白质结构功能比对情况,确定Kim家族系列基因。通过对目的基因cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE),确定zKim-1可能存在的剪接变体。结果应用NCBI/BLAST项目,从EMBL, Genbank and UCSC数据中,找到并证实了zKim-1(EMBL accession number ENSDARG00000091692), zKim-3(ENSDARG00000077257), and zKim-4(ENSDARG00000040178)三个Kim家族基因,位于21号染色体。其系统同源性分析表明zKim-1, zKim-3, zKim-4分别与hKIM-1, hKIM-3, hKIM-4在序列及结构上高度同源。cDNA末端快速扩增结果显示zKim-1存在的三个剪接变体,分别命名为长链zKim-1(zKim-1-L),短链zKim-1(zKim-1-S)及免疫球蛋白zKim-1(zKim-1-Ig)。结论1.首次发现并证实KIM家族基因在斑马鱼全基因组的分布情况。2.斑马鱼KIM家族基因序列具有与人类KIM家族基因序列高度同源性。3.蛋白结构上,斑马鱼KIM家族基因同样具有胞外信号肽,免疫球蛋白样结构域,粘蛋白结构域及胞内区酪氨酸磷酸化位点。4.zKim-1存在的三个剪接变体,即长链zKim-1(zKim-1-L),短链zKim-1(zKim-1-S)及免疫球蛋白zKim-1(zKim-1-Ig)。第二章zKim家族基因在斑马鱼各个组织器官中的表达情况及zKim-1蛋白表达调节及功能分析目的分析KIM家族基因及zKim-1剪接变体(长链zKim-1,短链zKim-1,免疫球蛋白zKim-1),在斑马鱼各个组织器官中的分布情况。依据,在肾脏损伤后,KIM-1在近曲肾小管上皮细胞显著表达的调节机制,探讨zKim-1是否具有与人类KIM-1蛋白相似的表达调节机制。体外实验,分析zKim-1是否具有与人类KIM-1蛋白相似的吞噬调亡细胞残骸及氧化脂质体的清理功能。方法通过,实时定量PCR分析Kim家族系列基因及zKim-1剪接变体(长链zKim-1,短链zKim-1,免疫球蛋白zKim-1),在斑马鱼各个组织器官中的分布情况。依据zKim-1在肾脏损伤后在近曲肾小管上皮细胞显著表达的调节机制,采用实时定量PCR,免疫荧光染色及免疫组化分析在庆大霉素导致急性肾脏损伤斑马鱼模型中zKim-1及其剪接变体表达调节情况。体外,与调亡细胞残骸及氧化脂质体共同培养,分析zKim-1表达细胞是否具有与人类KIM-1蛋白相似的吞噬功能。结果KIM家族基因在斑马鱼中各个正常器官中只有较少量表达,其中zKim-1在斑马鱼的鳍表达稍多,sKim-3在肌肉中表达稍多。zKim-1在损伤后的肾小管表达明显增加,而zKim-3, zKim-4的表达无明显变化,有统计学意义(P<0.05)。zKim-1具有对凋亡细胞及氧化脂质体的内吞作用。结论1.在健康正常组织中,KIM家族基因表达微量或检测不到。2.zKim-1具有与人类KIM-1蛋白相似的表达调节机制,即在肾脏损伤后,zKim-1显著表达于近曲肾小球上皮细胞。3.体外实验证实,zKim-1具有与人类KIM-1蛋白相似的吞噬凋亡细胞残体及氧化脂质体的清理功能。第三章Kim-1转基因斑马鱼模型构建及表型分析目的构建肾小管上皮细胞特异性表达Kim-1蛋白的转基因斑马鱼,探讨Kim-1表达对斑马鱼幼苗的前肾单位及斑马鱼成鱼的中肾单位的影响。方法首先,体外构建肾小管上皮细胞特异性表达zKim-1质粒载体。通过,分子克隆构建zKim-1与红色荧光融合蛋白线性基因片段。通过,特异性酶切位点,分子亚克隆将zKim-1耦合红色荧光蛋白基因(sKim-1-RFP)植入肾小管上皮细胞特异性表达载体质粒。我们采用在肾小管上皮细胞特异性表达的钙粘蛋白17(Cadherin17, cdh17)的启动子,介导zKim-1耦合红色荧光蛋白在斑马鱼幼苗的前肾单位及斑马鱼成鱼的中肾单位中表达。通过显微镜下纳米注射方法,将肾小管上皮细胞特异性表达zKim-1载体质粒导入斑马鱼的单细胞阶段的胚胎组织,并在荧光显微镜下实时观察zKim-1耦合红色荧光蛋白的表达情况。对照组,分子克隆构建钙粘蛋白17介导的肾小管上皮细胞特异性表达红色荧光蛋白,且无zKim-1整合基因序列的表达载体。同样,采用通过显微镜下纳米注射方法构建对照组斑马鱼模型。免疫印迹试验鉴别并验证Kim-1转基因斑马鱼模型,并检测Kim-1转基因斑马鱼模型的各项生理病理指标,包括斑马鱼幼苗的活动反映情况,心包积液及全身水肿表现。检测右旋糖酐在Kim-1转基因斑马鱼模型及对照组中肾小球滤过情况,反映斑马鱼幼苗的肾功能情况。通过,苏木素伊红染色检测Kim-1转基因斑马鱼模型及对照组的肾脏病理改变。免疫荧光染色检测相关蛋白的表达情况及其与zKim-1的相互关系。电子显微镜下进一步分析Kim-1转基因斑马鱼模型及对照组肾脏微观病理改变。结果与对照组比较,Kim-1转基因斑马鱼模型组出现明显的活动反映减弱。Kim-1转基因斑马鱼出现明显的心包积液及全身水肿,其严重程度与zKim-1在肾脏组织中的表达明显正相关。Kim-1转基因斑马鱼的肾功能出现显著下降,其右旋糖酐在肾小球的滤过情况明显延迟。Kim-1转基因斑马鱼的存活比例明显低于对照组,并与zKim-1在肾脏组织中的表况密切相关。肾脏病理方面,Kim-1转基因斑马鱼的肾小管形态不规则,管腔消失,可见部分肾小管上皮细胞脱落,水肿及空泡化。免疫荧光染色显示,在Kim-1转基因斑马鱼模型中,表达zKim-1的肾小管上皮细胞出现活化caspase3表达阳性。电子显微镜结果显示,Kim-1转基因斑马鱼的肾小管上皮细胞刷状缘脱落,胞浆中可见大量吞噬小体并伴有部分细胞核固缩。结论1.首次成功构建Kim-1转基因斑马鱼模型,可成为潜在的生物药学的研究工具,为人类急性慢性肾脏疾病的治疗提供新的靶点。2.Kim-1转基因斑马鱼出现多种近期及远期肾脏损伤表现,其对研究Kim-1在肾脏疾病中的急性慢性肾脏损伤的发生发展研究具有重要意义。3.肾小管上皮细胞特异性表达Kim-1诱导肾脏损伤,可能与Kim-1受体介导吞噬肾小管管腔中的一些潜在毒性或非毒性的蛋白质,导致细胞应激损伤。第四章条件性Kim-1转基因斑马鱼模型构建及持续性Kim-1表达在肾脏损伤中的病理生理作用目的构建肾小管上皮细胞条件性表达Kim-1蛋白的转基因斑马鱼,探讨Kim-1表达对斑马鱼幼苗的前肾单位及斑马鱼成鱼的中肾单位的影响。方法通过Cre/Loxp位点重组酶原理构建转基因斑马鱼。首先,体外构建构建表达的zKim-1与红色荧光融合蛋白线性基因片段。分子克隆构建zKim-1与红色荧光融合蛋白线性基因片段,特异性酶切位点,将zKim-1耦合红色荧光蛋白基因植入泛素(ubiquitin, ubi)启动的依赖Cre重组酶活性介导的加强绿色荧光蛋白与zKim-1耦合红色荧光蛋白替换的表达载体质粒。其次,体外构建构建肾小管上皮细胞特异性表达Cre的载体质粒。分子克隆构建Cre的线性基因片段,植入肾小管上皮细胞特异性表达的钙粘蛋白17(Cadherinl7, cdh17)作为启动子的表达载体质粒。通过显微镜下纳米注射方法,将表达载体质粒导入斑马鱼的单细胞阶段的胚胎组织,三个月后获得钙粘蛋白17介导的Cre转基因斑马鱼(cdh17:Cre)及启动的依赖Cre重组酶活性介导的加强绿色荧光蛋白与zKim-1耦合红色荧光蛋白替换的转基因斑马鱼(ubi:Loxp-EGFP-Loxp-zKim-1-RFP)。cdhl7:Cre转基因斑马鱼与ubi:Loxp-EGFP-Loxp-zKim-1-RFP转基因斑马鱼杂交后获得肾小管上皮细胞可调节性表达的Kim-1蛋白的双基因杂交斑马鱼。监测Kim-1可调节性双基因杂交斑马鱼的各项生理病理指标,包括斑马鱼幼苗的活动反映情况,心包积液及全身水肿表现。通过,苏木素伊红染色检测Kim-1可调节性双基因杂交斑马鱼的肾脏病理改变。免疫荧光染色检测相关蛋白的表达情况及其与zKim-1的相互关系。电子显微镜下进一步分析Kim-1可调节性双基因杂交斑马鱼的肾脏病理改变。结果与对照组比较,Kim-1可调节性双基因杂交斑马鱼同样出现明显的活动反映减弱,其心包积液及全身水肿的严重程度与zKim-1在肾脏组织中表达成显著正相关。Kim-1可调节性双基因杂交斑马鱼的存活比例明显低于对照组,与zKim-1在肾脏组织中表达程度有关。肾脏病理方面,Kim-1可调节性双基因杂交斑马鱼同样出现的肾小管形态不规则,管腔消失,可见部分肾小管上皮细胞脱落,水肿及空泡化。免疫荧光染色显示,在Kim-1可调节性双基因杂交斑马鱼模型中,表达zKim-1的肾小管上皮细胞出现末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL)阳性。电子显微镜结果同样显示,肾小管上皮细胞刷状缘脱落,胞浆中可见大量吞噬小体并伴有部分细胞核固缩。结论1.首次成功构建可调节性Kim-1转基因斑马鱼模型,排除Kim-1表达对斑马鱼前肾单位发育的影响因素,观察Kim-1表达对肾小管上皮细胞损伤的直接影响。2.可调节性Kim-1转基因斑马鱼可作为潜在的动物模型,应用于研究Kim-1在不同疾病背景下的病理生理作用,如糖尿病及慢性蛋白尿等。3.近一步证实肾小管上皮细胞损伤与特异性表达Kim-1有关,可调节性Kim-1转基因斑马鱼可作为药物筛选模型,应用于临床靶向治疗。