【摘 要】
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目的:通过体外细胞实验观察葡萄籽原花青素(GSPE)对造影剂所致的人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡损伤的保护作用,并探讨其保护作用的相关机制。方法:体外培养HK-2细胞,先用不同浓度的GSPE(10、20、40、60、80mg/L)与细胞共培养不同时间(6、12、24、36、48、72h),采用四甲基偶氮唑比色法(MTT)检测其对HK-2细胞增殖的影响。以及GSPE按上述浓度和时间与HK-2细胞共
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目的:通过体外细胞实验观察葡萄籽原花青素(GSPE)对造影剂所致的人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡损伤的保护作用,并探讨其保护作用的相关机制。方法:体外培养HK-2细胞,先用不同浓度的GSPE(10、20、40、60、80mg/L)与细胞共培养不同时间(6、12、24、36、48、72h),采用四甲基偶氮唑比色法(MTT)检测其对HK-2细胞增殖的影响。以及GSPE按上述浓度和时间与HK-2细胞共培养后,再加造影剂干预(干预方法:用第二代造影剂碘海醇100mg I/ml与HK-2细胞共培养6h),MTT法检测细胞活力的变化。根据以上结果确定GSPE的作用浓度和作用时间。然后实验分为6组,(1)对照组;(2)碘海醇组(100mg I/ml与HK-2细胞共培养6h);(3)GSPE组:GSPE与细胞共培养后加碘海醇干预(100mg I/ml与HK-2细胞共培养6h,下同);(4)CDDO-Im(Nrf2信号通路激活剂)组:CDDO-Im与细胞共培养后加碘海醇干预;(5)ML385(Nrf2信号通路抑制剂)组:ML385与细胞共培养后加碘海醇干预;(6)ML385+GSPE组:ML385和GSPE与细胞共培养后加碘海醇干预。后采用MTT法测定细胞增殖活力,磷脂酰丝氨酸蛋白抗体和碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染后流式细胞法检测细胞凋亡率,2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光结合流式细胞法检测细胞内活性氧(ROS),硫代巴比妥酸法测定细胞内丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物岐化酶(SOD)活性,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测Nrf2信号通路中Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1蛋白含量和细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的含量。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测Nrf2信号通路中Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1基因m RNA水平。结果:(1)与对照组相比,GSPE40mg/L与细胞共培养24小时可提高细胞增殖率(P<0.05)。与碘海醇组相比,GSPE40mg/L与细胞共培养24小时再加碘海醇干预,细胞活力明显升高(P<0.01)。(2)与对照组相比,碘海醇可明显降低HK-2细胞活力(P<0.01)、致其凋亡率升高(P<0.01)、使细胞内ROS含量增高(P<0.01)、MDA含量升高而SOD活性下降(P<0.01),同时诱导促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达上调(P<0.01),阻凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.05)。(3)与碘海醇组相比,GSPE和CDDO-Im处理组都能明显提高HK-2细胞活力(P<0.01)、降低细胞凋亡率(P<0.01)、使细胞内ROS含量降低(P<0.01)、MDA含量下降而SOD活性增强(P<0.05),同时上调Nrf2信号通路中Nrf2、NQO1、HO-1基因表达量和蛋白含量(P<0.01),并使促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达下调、阻凋亡蛋白Bcl-2表达上调(P<0.05)。(4)GSPE能升高Nrf2信号通路的抑制剂ML385所致的Nrf2、NQO1、HO-1基因和蛋白的低表达(P<0.05),进而对HK-2细胞显示出保护作用。结论:(1)GSPE对碘海醇所致的HK-2细胞的凋亡损伤具有明显的保护作用。(2)GSPE对HK-2细胞的保护作用可能是通过激活Nrf2信号通路进而调控其靶基因的表达而实现的。
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