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白藜芦醇(resveratrol,Res)是一种重要的植物抗毒素,除了有提高植物抵抗病原体的能力外,还具有多种有益于人类健康的生理活性。白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)是催化合成白藜芦醇的关键酶之一。
本研究以花生白藜芦醇合酶基因为基础,构建酵母表达载体及Ubi启动子驱动的单子叶植物表达载体,利用电穿孔法将A藜芦醇合酶基因整合到毕赤酵母GS115的染色体上,为下一步利用酵母作为生物反应器,大量表达该蛋白,应用于大规模的工业化生产白藜芦醇合酶提供载体;利用基因枪及农杆菌介导转化法将白藜芦醇合酶基因转导甘蔗,获得含白藜芦醇合酶基因的转基因苗,为培育抗逆性强的甘蔗新品种,作为生产白藜芦醇的原料打下基础。
本研究成功地构建了花生白藜芦醇合酶基因的酵母表达载体pPIC9K-RS,并通过电穿孔法将其整合到毕赤酵母GS115的染色体上。成功地构建了由Ubi启动子驱动的花生白藜芦醇合酶基因单子叶植物表达载体pA5-RS,分别利用农杆菌介导和基因枪转化法将其转导甘蔗。以培养25 d的胚性愈伤组织为最佳受体材料,农杆菌侵染浓度为OD<,600>=0.8,侵染时间10 min,AS活化浓度200 μmol/L,共培养时间2 d,在含羧卞青霉素150 mg/L+潮霉素50mg/L的培养基上进行筛选培养;基因枪转化法的轰击系数为轰击压力1 100 psi,轰击距离6cm,真空度28 inchs Hg。通过PCR检测,农杆菌介导转化法获得的5株抗性苗中1株为阳性苗,基因枪转化法获得的11株抗性苗中3株为阳性苗。