论文部分内容阅读
背景: 胃癌作为我国第二大恶性肿瘤，总体5年生存率不到20％，缺乏特异性早期诊断方式和有效治疗方法是目前的研究短板。CXCL14(C-X-C motif chemokineligand14)，作为趋化因子CXC子家族中新的一员，近年来发现在人体大部分组织中普遍表达。而在不同的人体恶性实体肿瘤中CXCL14的表达情况高低不一。但在胃恶性肿瘤中CXCL14的表达水平和临床意义未见报道。 目的: 检测胃癌组织和配对正常胃粘膜组织中CXCL14的表达情况，探讨表达差异的形成原因，并联系临床病理分型，寻找在临床上的应用意义。 方法: 利用实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)的方法检测60例肿瘤/正常配对样本中CXCL14信使RNA水平的表达差异。蛋白印迹法(Western Blot)验证多克隆抗原特异性后，免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry)检测30例肿瘤/正常配对样本中CXCL14蛋白水平的表达差异。CXCL14 DNA启动子区域甲基化水平采用重亚硫酸盐测序法(bisulfite sequencing PCR)验证。将胃癌细胞株AGS、SCG7901、BGC823和MGC803在去甲基化药物地西他滨（5-Aza-2-deoxycytidine）不同浓度梯度处理后，采用Realtime-PCR检测CXCL14信使RNA表达恢复情况。最后联系临床病理分型和生存分析，利用卡方检验、Students T检验、Kruskal-Wallis H检验、Kaplan-Meier生存曲线、Cox回归方程等统计方法探讨CXCL14的临床意义。 结果: 相对于配对胃正常粘膜组织，CXCL14信使RNA在胃癌组织中的相对表达量为0.569，两者差异有统计学意义（P＜0.001）。在配对胃正常粘膜组织中CXCL14蛋白半定量表达水平约为90％以上，而肿瘤组织中蛋白水平降为60％左右，两者差异存在统计学意义(P＜0.001)。在30例配对胃癌组织标本中，正常组织中CXCL14 DNA启动子区域51个甲基化位点整体甲基覆盖率为14.58％(223/1530)，而肿瘤组织中甲基化水平高于正常组织2倍以上，为32.29％(494/1530)，两者差异有统计学意义（P＜0.001）。将51个甲基化位点细分为启动子区域和第一外显子区域时，发现主要的甲基化差异存在于启动子区域，正常/肿瘤组织甲基化率为13.96％(201/1440)∶32.36％(466/1440)，两者差异存在统计学意义（P＜0.001）。而第一外显子区域未见明显统计学差异(P=0.498)。再将甲基化位点逐一分析，发现第2、6、7、8、9号甲基化位点在正常组织中甲基化率为0，而肿瘤组织中高达40.67％，差异存在统计学意义（P＜0.001）。转向细胞实验，当地西他滨处理胃癌细胞株AGS、SCG7901、BGC823和MGC803五天后，AGS、SCG7901和BGC823中CXCL14信使RNA的表达量得到提高(P＜0.001)。但在不同的药物浓度之间，表达恢复情况未见统计学差异（P＞0.05）。AGS细胞DNA甲基化测序分析示在去甲基药物处理后，CXCL14启动子区域甲基化率从用药前的85.62％下降到12.55％(P＜0.001)，但在药物浓度梯度之间甲基化水平改变仍未见明显统计学差异（P＞0.05）。结合临床病理分型，CXCL14信使RNA水平和肿瘤浸润深度存在相关(P＜0.001)，且对肿瘤中晚期病人（Ⅲ/Ⅳ期）的5年生产率存在影响。最后它作为一个判断胃癌预后的独立保护因素，相对危险度为0.394(95％ CI,0.195,0.793; P=0.009)。 结论: 1.CXCL14可能涉及胃癌发生发展和预后情况; 2.启动子异常高甲基化是造成CXCL14在胃癌组织中表达降低或缺失的原因之一，且这种抑制表达是可逆的; 3.CXCL14的表达水平可能在预测胃癌预后中作为一个有意义的判断因素，但还有待进一步的研究和验证。