【摘 要】
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马动脉炎病毒(EAV)的N蛋白基因是该病毒的保守基因.该研究克隆了N蛋白基因保守区域,并制成标准品.设计一对特异引物和一条荧光探针,用于实时荧光定量RT-PCR检测EAV的研究.这
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马动脉炎病毒(EAV)的N蛋白基因是该病毒的保守基因.该研究克隆了N蛋白基因保守区域,并制成标准品.设计一对特异引物和一条荧光探针,用于实时荧光定量RT-PCR检测EAV的研究.这对于应用实时荧光定量RT-PCR方法检测EAV做出了初步探索.主要研究内容如下:1.用RK-13细胞增殖EAV.在GeneBank中查出EAV标准株N蛋白的基因序列,利用Primer Premier 5.0软件进行分析,设计出一对引物.利用普通RT-PCR的方法从病毒核酸中扩增出大小为266bp的目的基因.利用其两端的BamHI和EcoRI酶切位点酶切后产生的粘性末端,将其插入体外转录载体PGEM-4Z中.将双酶切鉴定的阳性质粒命名为PGEM-N.经序列测定分析表明,克隆基因与EAV标准株N蛋白基因序列的同源率达100％.2.利用T7体外转录试剂盒和PGEM-4Z载体上的T7启动子,在体外转录出EAV标准株N蛋白基因的RNA序列.3.利用Primer Express software(专用于设计实时荧光定量PCR反应使用的引物和探针的软件)设计一对特异引物和一条长22bp的水解探针.4.通过实时荧光定量RT-PCR预实验,确定引物的用量是4.0 μ l.分别将样品中的EAV病毒核酸和体外转录的RNA做10倍稀释,分别以它们做模板进行实时荧光定量RT-PCR扩增,绘制出两条扩增曲线,其斜率之差(△S)等于0.0776462,小于0.1.这就说明两者的扩增效率是相同的,即转录产物RNA对于EAV的定量是可靠的.
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