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目的:
本研究通过采用紫外线照射法、次氯酸钠溶液消毒法及高压蒸汽灭菌法三种方法对抗酸染色痰涂片进行前处理，评价其对抗酸染色镜检的影响及其消毒效果。为资源有限、处于结核病职业暴露高危环境中的基层实验室工作人员进行抗酸染色痰涂片镜检，提供简单、经济、实用的方法，灭活涂片中分枝杆菌，以提高基层实验室生物安全。
方法:
1.收集萋尼氏抗酸染色阳性的痰液，并测定紫外线照射距离、辐照强度，以及次氯酸钠溶液有效氯浓度。
2.痰涂片抗酸染色镜检及分枝杆菌培养:将痰液充分混匀后分为四份，分别用于对照组、紫外线照射组、次氯酸钠溶液消毒组及高压蒸汽灭菌组。对照组首先采用直接涂片方式制备2张涂片，一张进行抗酸染色，作为涂片镜检对照;一张经火焰固定后刮取痰膜进行分枝杆菌培养;剩余痰液接种改良罗氏培养基进行分枝杆菌分离培养，作为培养对照。紫外线照射组将涂片置于生物安全柜内紫外灯下，分别照射10min、20min、40min、60min、80min后进行抗酸染色镜检及分枝杆菌培养。次氯酸钠溶液消毒组的痰液因向痰液中加入等量次氯酸钠溶液消化处理10～15min后，集菌方法不同，分为两小组，一组离心法是加入等量的蒸馏水，混匀，然后以2500rpm速度离心15min;一组沉淀法则是加蒸馏水至15mL，混匀，室温中静置过夜(15h～18h)。两组集菌后取沉淀进行涂片染色镜检以及接种培养。高压蒸汽灭菌组将痰液放入高压蒸汽灭菌锅中(压力103.4kPa，温度121℃)，灭菌20min后以2500rpm速度离心15min，取沉淀进行涂片抗酸染色镜检。因高压蒸汽灭菌可杀灭所有微生物，故高压灭菌后的痰液不再进行培养工作。
3.菌种鉴定:培养对照分离培养阳性菌株，进行菌种鉴定。采用双重PCR进行分枝杆菌菌群鉴定，划归是结核分枝杆菌复合群(MTBC)或非结核分枝杆菌(NTM)。鉴定结果若是MTBC，则采用7对结核分枝杆菌复合群各菌种特异性引物进行PCR扩增，进行MTBC菌种鉴定;鉴定结果若是NTM，则采用DNA微阵列芯片法进行NTM菌种鉴定。
结果:
1.本次研究共收集抗酸染色阳性痰液73份，直接涂片染色镜检结果为抗酸杆菌阳性1～8条/300视野8份，抗酸杆菌阳性(1+)6份，抗酸杆菌阳性(2+)18份，抗酸杆菌阳性(3+)11份，抗酸杆菌阳性(4+)30份。痰分枝杆菌分离培养对照结果与火焰固定后培养结果相同，共分离分枝杆菌阳性菌株65株，经鉴定MTBC60株，其中结核分枝杆菌58株，田鼠分枝杆菌2株;NTM5株，其中龟脓肿分枝杆菌4株，胞内分枝杆菌1株。
2.紫外线照射组，其痰涂片上抗酸杆菌的染色性、形态以及其Z-N抗酸染色镜检分级结果均与对照组涂片相同，即紫外线照射痰涂片不影响其抗酸染色镜检。辐照度为332～360μw/cm2的紫外线，照射60min，即紫外线辐照剂量达到1195200μw·s/cm2～1296000μw·s/cm2时，痰涂片分枝杆菌培养均为阴性，即达到杀灭分枝杆菌的目的。用相同辐照强度的紫外线照射痰涂片，其杀灭分枝杆菌的效果与照射时间、涂片含菌量有显著关系（P＜0.05）。对同一痰液样本，随着紫外线照射时间的延长，培养生长的菌落数逐渐少。紫外线辐照强度、照射时间相同的情况下，菌量与培养阳性比例存在线性趋势（P＜0.05)，菌量越多，培养阳性比例越大，即杀菌效果越差。要达到杀灭分枝杆菌的目的，菌量越多，需照射时间越长。
3.本次研究显示有效氯浓度为50g/L的次氯酸钠溶液处理痰液10～15min，其涂片抗酸染色镜检镜下视野背景单一、干净、清晰，次氯酸钠溶液离心法与沉淀法镜检结果没有显著差异(P＞0.05)，但与对照组相比，其镜检结果分级显著低于对照组（P＜0.05)，并出现高假阴性。该组中所有分枝杆菌培养均为阴性。
4.高压蒸汽灭菌组，其镜下背景干净、清晰，经离心后其抗酸染色镜检结果分级与对照组有显著差异（P＜0.05)，高于对照组。痰液经高压灭菌后，涂片痰膜较脆弱，在染色过程中，易脱落，影响随后的显微镜检查。
结论:
1.火焰固定不能杀死涂片中的分枝杆菌，在日常工作中，涂片进行抗酸染色之前，进行前处理，灭活分枝杆菌，对降低实验室获得性感染，提高实验室生物安全有重要意义。本研究证实紫外线照射法、次氯酸钠溶液消毒法可灭活痰涂片中的结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、龟脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌。
2.紫外线照射对痰涂片抗酸染色镜检没有影响。利用紫外线消毒痰涂片，涂片制备要厚度适宜、涂抹均匀，紫外线辐照剂量至少达到1195200μw· s/cm2，使用中的紫外线灯管应定期擦拭清洁，并对其辐照强度进行监测，及时更换灯管。
3.50g/L的次氯酸钠溶液处理痰液10～15min可有效的杀灭痰液中的分枝杆菌，但对抗酸染色镜检结果有一定的影响，次氯酸钠溶液要低温、避光保存，减少有效氯浓度的下降。
4.高压蒸汽灭菌可杀灭所有微生物，安全。本研究显示此方法镜检结果分级提高，集菌效果显著。但痰膜脆弱，染色过程中要谨慎，防止痰膜脱落。此法适合大批量样本的处理。