水稻瘤矮病毒S2序列分析与S11抗血清制备

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水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)是中国、日本、朝鲜、韩国以及马来西亚等东南亚国家水稻上的一种重要病毒,引起水稻瘤矮病。RGDV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae),植物呼肠孤病毒属(Phtoreovirus),该属中还包括水稻矮缩病毒(Ricedwarf virus,RDV)和三叶草伤瘤病毒(Wound tumor virus,WTV)。其基因组包含12条双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)片段,目前泰国分离物的测序工作已经完成,但只对基因组部分片段的功能有所了解。中国分离物除S2、S4和S5外都已报道。 根据报道的RGDV泰国分离物组分S2的核苷酸序列设计分段引物,以病株叶片总RNA为模板进行RT-PCR,获得了广东从化分离物片段2(Segment 2,S2)的全序列。经测定RGDV中国广东从化分离物基因组S2片段全长共有3514 bp,cDNA序列含1140个A,732个G,1009个T,633个C,G+C含量为38.84%。该序列中含有一个开放阅读框,该ORF含3447 bp,起始于第14位,终止于第3460位,编码一个含1148个氨基酸的结构蛋白P2,推测分子量为127.488 kDa。5’端和3’端都有一个非翻译区,长度分别为13 bp和54 bp。 将从化分离物(RGDV-CFI)与泰国分离物(RGDV-T)和信宜分离物(RGDV-C)的全序列相比,它们的核苷酸长度相等,都为3514 bp,其同源率分别为96.8%和99%,突变都发生在编码区内。RGDV-CH与RGDV-T相应片段的GC含量、编码区和非编码区的长度、末端保守序列、基因组片段特异反向重复序列等基因组组织结构上基本一致。对3个分离物推导出的氨基酸序列进行分析比较,从化与泰国、信宜分离物S2编码的多肽同源率分别为98.3%和98.9%。虽然在核苷酸序列亲缘关系和地理区域分布上从化分离物与信宜分离物较近,但是在编码多肽的物理性质上同泰国分离物更为接近。 RGDVS11编码的Pns11蛋白是一个RNA沉默抑制子,通过抑制沉默信号的产生或阻止沉默信号的传递抑制正义GFP RNA引起的局部和系统基因沉默,在局部和系统沉默抑制实验中能降低小干扰RNA(short interference RNA,siRNA)的累积。S11的功能通过蛋白实现而非其RNA。为方便进一步研究Pnsll的功能,本研究利用已构建的Pns11原核表达载体表达蛋白并成功制备了抗血清。 利用含已构建的pBV-S11原核表达载体的Escherichia.coli DH5α菌株经42℃诱导表达出40kDa的非融合蛋白,SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量与预期的Pnsll蛋白分子量相符。将获得的Pns11蛋白免疫健康白兔制备了专化性抗血清,间接ELISA测定其抗血清效价为1:4096。
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