论文部分内容阅读
CD4+T淋巴细胞根据标志性转录因子和分泌的细胞因子不同，可分为Th1，Th2，Th17和Treg四个细胞亚群。Th1细胞亚群中标志性转录因子为T-bet，分泌的主要细胞因子是IFN-γ和IL-12。DC细胞产生的IFN-γ可以上调CD4+ T细胞中T-bet的转录水平，进而促进CD4+ T细胞向Th1细胞分化，同时T-bet能结合在IFN-γ的启动子上增强Th1细胞自身进一步产生IFN-γ。然而在硬骨鱼中存在两个II型干扰素基因，IFN-γ2和IFN-γrel（又名IFN-γ1），其中后者的免疫功能地位并不清楚。为了清楚草鱼IFN-γrel的功能特性，本课题将草鱼的IFN-γrel成熟肽编码序列克隆至原核表达载体 pET30a(+)，通过多次优化诱导表达体系，大量目的蛋白出现在包涵体中，进而尝试透析复性，稀释复性等多种方法以期获得具有生物学活性的重组蛋白，但经凝胶层析或亲和层析纯化得到纯度较高的蛋白后，Real-time PCR结果分析显示重组蛋白无法调节下游基因的表达。故将IFN-γrel编码区克隆至真核表达载体pcDNA3.1-myc-his，转染细胞系HEK293细胞48小时后，收集并浓缩培养基，Western blotting分析表明IFN-γrel蛋白表达成功并分泌到胞外，Real-time PCR结果分析显示真核表达的蛋白能够上调草鱼头肾白细胞中IL-8的基因表达，证明重组蛋白具有生物学活性。鉴于Th1细胞亚群中IFN-γ和标志转录因子T-bet的密切关系，草鱼T-bet被克隆和鉴定，序列比对和进化树分析显示其是哺乳动物T-bet的同系物。同时，草鱼T-bet特异多克隆抗体的验证，为下一步检测其蛋白表达水平打下了基础。综上所述，本课题初步探讨了Th1细胞亚群中草鱼IFN-γrel的重组表达、蛋白纯化和免疫学功能，同时分离鉴定了特异的转录因子T-bet，不仅揭示了鱼类IFN-γ基因的结构和功能进化信息，而且为判断鱼类Th1细胞亚群的存在奠定了基础。