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近年来,随着氨基糖苷类药物在兽医临床上的广泛使用,使得动物源细菌对其产生严重的耐药性。动物源耐药菌有可能在养殖场周围土壤环境中进行扩散和传播,导致养殖场周围上壤环境也出现耐药菌。16S rRNA甲基化酶是近年来新出现的细菌对氨基糖苷类药物的耐药机制。木论文初步研究了养猪场中猪粪分离菌和猪场附近上壤分离菌中16S rRNA甲基化酶基因的流行状况和传播机制,旨在为养殖场合理使用氨基糖苷类药物提供依据,同时也为减少耐药基因在不同环境传播提供思路。
本研究从江西某猪场采集102份猪粪样品和97份猪场附近土壤样品(55份猪场内上壤样品和42份猪场外土壤样品)、以及56份非猪场附近农田土壤样品,筛选样品中的阿米卡星耐药菌株,采用PCR方法检测16S rRNA甲基化酶基因,对阳性菌进行生化鉴定和16S rRNA基因序列鉴定。结果从55份猪粪样品中获得56株rmtB阳性肠杆菌,包括54株大肠杆菌、1株奇异变形杆菌和1株摩氏摩根菌:从土壤样品中获得19株rmtB阳性肠杆菌株,包括13株大肠杆菌、2株摩氏摩根菌、2株非脱羧勒克菌、1株产气肠杆菌和1株阴沟肠杆菌。猪粪样品中rmtB检出率为53.9％,高于猪场附近土壤样品的检出率(15.5%);猪场外土壤样品中rmtB检出率为7.1%,高于非猪场附近土壤样品的检出率(1.8%)。未检测到其他16S rRNA甲基化酶基因,说明猪场丰要流行的16S rRNA甲基化酶基因型是rmtB，采用琼脂稀释法对rmtB阳性菌进行11种抗菌药物的敏感性试验,结果显示rmtB阳性菌对萘啶酸、诺氟沙星、环丙沙星、氯霉素、氟苯尼考、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶和四环素的耐药率均在70%以上,对新霉素的耐药率在45%～65%,对头孢噻肟的耐药率在37%左右。
采用PCR和测序方法检测rmtB阳性菌中blacTX-M和qepA基因,结果显示25株rmtB阳性菌携带blaCTX-M基因,29株rmtB阳性菌携带qepA基因。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和接合试验方法分别从垂直克隆传播和水平传播研究rmtB基因的传播机制。PFGE分型结果表明,大部分rmtB阳性菌为非克隆传播关系,但发现猪场外土壤和猪场内土壤存在小部分克隆传播现象。47株猪源rmtB阳性菌和11株猪场附近土壤源rmtB阳性菌获得接合子,对接合子进行复制子分型,发现rmtB和qepA常共同位于约80kb的IncF质粒上,rmtE和blaCTX-M-65常共同位于约65kb的IncF质粒上。此外,部分,rmtB阳性质粒属于IncN型。对rmtB阳性大肠杆菌系统进化分析,结果发现rmtB阳性大肠杆菌丰要分布在A组(71.6%),其次是B1(16.4%)和D(10.5%)组,B2(1.5%)组极少。
本研究结果表明,rmtB基因是猪场和猪场附近土壤环境中流行最为广泛的质粒介导的16S rRNA甲基化酶基因。耐药菌株的克隆传播和耐药质粒的水平传播是导致rmtB在猪场内及附近上壤环境中流行的原因。rmtB常携同blaCTX-M和qepA基因一起通过质粒传播,导致细菌对多种抗菌药物产生耐药性。因此,养殖场应谨慎使用抗菌药物,以防止耐药菌的进一步扩散。