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RUNX1和RUNX2是转录因子RUNX家族成员,在人和鼠的卵泡发育和排卵等多种生殖过程中扮演着重要的角色,然而它们在奶山羊卵泡中的表达调控机理仍不是十分清晰。因此,本研究以关中奶山羊卵巢颗粒细胞为研究对象,使用免疫组化、免疫荧光、real-time PCR、western blot、ELISA、CCK-8、EdU和流式细胞术等方法,研究了hCG、miR-181b和miR-222在关中奶山羊卵巢颗粒细胞中对RUNX1和RUNX2的表达调控机理,以及RUNX1、RUNX2、miR-181b和miR-222对奶山羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡以及激素分泌的作用。主要研究结果如下:1.RUNX1和RUNX2在关中奶山羊卵巢组织中的表达分析Real-time PCR的结果显示,RUNX1和RUNX2 mRNA在关中奶山羊的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、乳腺、子宫、输卵管和卵巢组织中均有表达,在乳腺中表达量最高,在肌肉中表达量最低。免疫组化分析结果表明,RUNX1和RUNX2蛋白在腔前卵泡的颗粒细胞和卵母细胞,有腔卵泡的颗粒细胞、卵母细胞和膜细胞,以及黄体中表达。2.hCG对奶山羊卵巢颗粒细胞中RUNX1和RUNX2表达的影响奶山羊卵巢颗粒细胞经过1 IU/mL hCG处理0、2、4、8、12、16、24 h后发现,RUNX1和RUNX2 mRNA表达水平在2 h时显著增加,hCG以时间依赖的方式持续促进RUNX1和RUNX2的蛋白表达。接着,通过加入hCG调节的信号通路的激活剂和抑制剂发现,在2 h时,hCG诱导RUNX1 mRNA的表达依赖于PKC和PI3K的激活,而hCG诱导RUNX2 mRNA的表达依赖于cAMP、PKC和PI3K的激活。3.MiR-181b和miR-222对hCG诱导RUNX1和RUNX2表达的作用使用生物信息学分析发现,RUNX1 3’UTR区有一个miR-181b结合位点,RUNX23’UTR区有一个miR-221/222结合位点(miR-221和miR-222具有相同的种子序列)。构建野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,分别和NC、miR-181b、miR-221和miR-222mimics转染293T细胞和奶山羊卵巢颗粒细胞24 h后发现,miR-181b可以与RUNX13’UTR区结合降低荧光素酶活性,miR-222可以与RUNX2 3’UTR区结合降低荧光素酶活性。Real-time PCR和western blot结果显示,miR-181b下调RUNX1 mRNA和蛋白的表达,miR-222抑制RUNX2 mRNA和蛋白的表达,说明RUNX1是miR-181b的一个靶基因,RUNX2是miR-222的一个靶基因。奶山羊卵巢颗粒细胞经1 IU/mL hCG处理0、2、4、8、12、16、24 h后发现,miR-181b的表达水平显著下降并始终维持在较低水平;而miR-222的表达量在hCG处理2、4和12 h时显著增加,4 h最高,其他时间则无变化。接着,通过加入hCG调节的信号通路中的激活剂和抑制剂发现,在4 h时,hCG通过激活cAMP/PKA和PKC信号通路抑制miR-181b的表达,hCG则通过激活PKC和PI3K信号通路促进miR-222的表达。转染野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体24 h,加入DMSO、hCG、FSK和PMA继续培养4 h后,hCG和PMA可以显著增加RUNX1-3’UTR组的荧光素酶活性;而只有hCG能够显著降低RUNX2-3’UTR组的荧光素酶活性降低。说明,miR-181b和miR-222直接参与调节hCG诱导的RUNX1和RUNX2的表达。4.RUNX1和RUNX2对奶山羊卵巢颗粒细胞激素分泌和增殖凋亡的效果用1 IU/mL hCG对奶山羊卵巢颗粒细胞处理0、2、4、8、12、16、24 h后发现,hCG在12 h和16 h时显著增加了培养液中雌激素的浓度。然后,使用siRNA成功干扰了RUNX1和RUNX2的表达。在无hCG处理时,降低RUNX1的表达可以显著抑制雌激素的生成,但是对孕酮生成无影响;降低RUNX2的表达对孕酮和雌激素的生成均无影响。在有hCG处理时,干扰RUNX1和RUNX2的表达可以抑制hCG诱导的孕酮生成,而对hCG诱导雌激素的生成没有作用。抑制RUNX1和RUNX2的表达均可以显著降低类固醇激素合成酶基因StAR、HSD3B和CYP11A1 mRNA的表达水平和hCG诱导的StAR、HSD3B和CYP11A1 mRNA表达量,而对CYP19A1 mRNA的表达和hCG诱导的CYP19A1 mRNA表达水平无影响。通过对StAR、HSD3B和CYP11A1基因启动区转录活性分析发现,它们的启动子区均含有多个RUNX1和RUNX2结合位点,且RUNX1可以分别与CYP11A1启动子区-266~-256和-252~-242、HSD3B启动子区-1805~-1795、-1681~-1671和-1327~-1317、StAR启动子-1180~-1170、-1084~-1074和-258~-248相结合正向调节它们的转录;RUNX2可以分别与CYP11A1启动子区-255~-241、HSD3B启动子区-1808~-1794、-1684~-1670和-1330~-1316、StAR启动子-1087~-1073结合正向调节它们的转录。CCK-8和EdU染色结果表明干扰RUNX1和RUNX2的表达在24 h时可以显著促进奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖。接着,流式细胞术的结果说明在48 h时,干扰RUNX2的表达可以显著抑制奶山羊卵巢颗粒细胞凋亡,过表达RUNX2则能显著促进奶山羊卵巢颗粒细胞的凋亡;而RUNX1对奶山羊卵巢颗粒细胞的凋亡无明显作用。5.MiR-181b和miR-222对奶山羊卵巢颗粒细胞激素分泌和增殖凋亡的作用使用ELISA检测miR-181b和miR-222对奶山羊卵巢颗粒细胞激素分泌的影响,无论hCG存在与否,miR-181b和miR-222对培养液中孕酮的浓度都没有影响,而miR-222则可以刺激奶山羊卵巢颗粒细胞雌激素的生成。接着EdU检测结果发现,miR-181b和miR-222在48 h时显著促进了奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖。流式细胞术的结果表明,在48 h时,miR-181b能够抑制奶山羊卵巢颗粒细胞的凋亡,而miR-222则对奶山羊卵巢颗粒细胞的凋亡无影响。综上所述,在关中奶山羊卵巢颗粒细胞中,miR-181b和miR-222不仅受到了hCG的调节,还直接参与调控hCG诱导RUNX1和RUNX2的表达。RUNX1和RUNX2可以直接与StAR、HSD3B和CYP11A1启动子区结合促进它们的转录,进而促进hCG诱导的孕酮的生成。除此之外,RUNX1、RUNX2、miR-181b和miR-222参与调节奶山羊卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡。以上研究结果为进一步阐明RUNX1和RUNX2在调控卵泡发育及卵巢功能的机理提供了试验依据。