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利用纤维类固体废弃物生产酒精来作为一种替代能源已引起研究者们越来越大的兴趣,绿色木霉(Trichoderma viride)具有一个高效的纤维素酶体系,单独研究这一酶系的某个成分,可能会影响对这一体系的组成与功能机理的理解.该论文以绿色木霉(T.viride)AS 3.3711、CICC13038、T4为出发菌株;克隆载体为pMD18-T,其宿主菌株为大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α);采用带有高效半乳糖诱导启动子的pYES2作为酿酒酵母表达载体,以酿酒酵母H158(Saccharomyces cerevisiae H158)为表达载体宿主菌.研究了绿色木霉(T.viride)整个纤维素酶系的基因的表达和特性.采用DNS法比较了三个绿色木霉(T.viride)菌株的CMC酶活和β-葡萄糖苷酶酶活,选出了酶活较高的菌株作为出发菌株;采用RT-PCR和PCR方法克隆到绿色木霉(T.viride)的纤维素酶系基因的大多数全长cDNA片段和部分全长DNA片段,测序后将cDNA片段构建到酿酒酵母(S.cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上;研究了超声波对酿酒酵母完整细胞转化的影响,并用正交实验对超声波辅助酵母转化系统进行了优化.该论文从3个绿色木霉(T.viride)菌株中用选出的高纤维素酶活性的菌株(T.viride AS3.3711、CICC 13038)中提取总RNA和DNA,通过引物设计,用RT-PCR和PCR方法克隆得到了3种内切葡聚糖酶(EGI、EGⅢ、EGV)、2种纤维二糖水解酶(CBHI、CBHⅡ)和2种β-葡萄糖苷酶(BGLI、BGLⅡ)的cDNA片段,及EGI、EGⅢ、EGV的DNA片段,共10个基因片段.比较了在相同条件下7种转化子的混合培养和BGLⅠ转化子单独培养的β-葡萄糖苷酶活性,结果表明在相同条件下7种转化子的混合培养的β-葡萄糖苷酶活性极显著地高于BGLⅠ转化子单独培养的β-葡萄糖苷酶活性;从培养周期上看,BGLⅠ转化子单独培养的酶活高峰在培养的72h时出现,酶活为0.039UmL<-1>,混合培养的β-葡萄糖苷酶活为0.042 UmL<-1>显著高于BGLⅠ单独培养的酶活;混合培养的酶活高峰在培养的84h时出现,酶活为0.066UmL<-1>,极显著地高于BGLⅠ单独培养的酶活0.032 UmL<-1>.这一研究是纤维素酶基因工程研究的一个新探索.绿色木霉(T.viride)的cDNA片段的克隆与发表,为进一步研究绿色木霉纤维素酶系基因在酿酒酵母(S.cerevisiae)等其他细胞中的表达及重组酶的特性提供了重要的材料;为其他有关绿色木霉纤维素酶系基因的研究提供了重要依据.通过对转化子的Northern杂交检测,一方面证明了所建立的超声波辅助酵母完整细胞转化法可以高效的将质粒转入酿酒酵母细胞,这一转化体系的建立,为酿酒酵母(S.cerevisiae)的遗传转化工作提供了一个高效方法.另一方面转化子的获得为下一步研究绿色木霉纤维素酶系基因的表达奠定基础.