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多聚亚基蛋白质疫苗在层析中存在稳定性差、分离纯化难、收率低的问题，并对疫苗产品的稳定性和免疫原性产生很大影响。本论文以乙肝疫苗(重组CHO细胞(Chinese Hamster Ovary)表达的乙肝疫苗(CHO-HBsAg)和汉逊酵母细胞(Hansenula polymorpha)表达的乙肝疫苗(Hans-HBsAg))和百日咳疫苗(百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA))两种多聚亚基疫苗为研究对象，对其在层析中的稳定性进行了考察，并从溶液环境的调整、层析介质的设计和制备、层析工艺的设计和优化等角度出发，来提高疫苗在层析中的稳定性和分离纯化效果。本论文开展的研究工作如下：
1.蛋白质在离子交换吸附过程中发生强烈的多位点吸附，而介质配基密度的降低有利于减弱蛋白质与介质间的相互作用。为克服现有商用离子交换介质的不足，制备了新型的低配基密度DEAE介质，并将其用于CHO-HBsAg的分离纯化。实验结果表明，低配基密度DEAE介质的应用，减弱了CHO-HBsAg与介质间的多位点吸附，提高了疫苗在吸附，解吸过程中的稳定性，减少了因结构变化导致的活性损失，达到了稳定疫苗结构和提高层析效果的目的，将CHO-HBsAg的活性回收率和纯化倍数分别由原来的44.1％和9.4提高到65.6％和10.4。
2.为了减少高配基密度疏水介质对乙肝疫苗亚基结构的影响，设计和开发了新型低配基密度疏水层析介质(Butyl-S QZT-3)，将Hans-HBsAg在疏水层析中的活性回收率和纯化倍数分别从79％和4.2提高到95％和10.5；同时，添加剂PEG(polyethylene glycol)的加入，将Hans-HBsAg在超滤浓缩中的活性回收率从30％提高到95％左右。进一步地，在整个纯化工艺整合中，为解决现有Hans-HBsAg分离纯化工艺操作繁琐、收率低和不易放大的难题，以及提高非糖基化Hans-HBsAg的稳定性，发展了一条基于三大层析技术(离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析)和膜超滤浓缩的组合层析工艺。中试实验结果表明，该工艺具有操作步骤少、各单元操作衔接合理和容易放大的特点，而且Hans-HBsAg活性回收率达到22.0士8.3％，比传统工艺提高了一倍左右，操作时间也从近100小时缩短到35小时左右。低温保存Hans-HBsAg的稳定性考察实验结果表明，采用该工艺制备的Hans-HBsAg具有良好的稳定性。
3.在百同咳疫苗分离纯化过程中，通过添加剂(如0.5～1.0mol/L NaCl或2mol/L脲)的加入，提高了PT和FHA在溶液中的稳定性。开发了一条采用自制的配基密度可控的结合珠蛋白(Hp)亲和介质制备单组分百日咳疫苗(PT)的层析工艺。实验结果表明，配基的纯化方法、配基的纯度和密度都对Hp亲和层析分离纯化PT具有重要影响。当采用DEAE离子交换层析制备Hp配基，配基纯度高于95％，配基密度为0.70 mg Hp/g wet gel时，Hp亲和介质的层析效果最好，单步层析即可制备电泳纯PT，其活性回收率为38.2％。
4.通过层析介质的筛选、添加剂的应用和层析工艺的设计，开发了一条用于双组分百日咳疫苗(PT和FHA)制备的脲伴随式组合层析工艺：硫酸铵沉淀-离子交换层析-凝胶过滤层析，实现了电泳纯PT和FHA的制备，其中PT的活性回收率和纯化倍数分别达到26.8％和37.8，FHA的活性回收率和纯化倍数分别达到37.5％和23.3。在层析工艺中，CM Sepharose FF离子交换层析纯化效果最为显著，去除了大量的杂蛋白，但未能实现PT和FHA的有效分离；而Sephacryl S-200凝胶过滤层析主要起到了分离PT和FHA的目的，同时还实现了PT和PT亚基的分离；添加剂2mol/L脲的引入，则起到提高PT和FHA在层析中的稳定性和层析效果的作用。