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RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。Ago(Argonaute)蛋白家族是含有PIWI和PAZ基本结构域的一类成员数目较多的蛋白家族,近年来研究发现Ago蛋白家族的很多成员在RNA干扰现象中有重要的作用。在果蝇和人体细胞中,Ago2(Argonaute2)为RNA干扰机器RSIC(RNA-induced silencing complex)的核心部分,在RNA干扰中发挥关键的作用。
P-Body(Cytoplasmic Processing Body)最初在酵母中发现。在它细胞中与RNA降解有关。目前已经发现很多和RNA转录调控、RNA降解以及相关的蛋白在P-Body内聚集。现在,已有充分证据证明RNAi体系和P-body的形成有关联。例如RNA干扰机器RSIC上的核心蛋白Ago2也在P-body内聚集;Ago2与mRNA的结合会影响P-Body在细胞的存在状态等等。因为Ago2及P-Body和RNAi现象紧密联系,所以研究Ago2在P-Body内的定位对于了解P-Body和RNAi的关系有重要的意义。
本论文通过构建一系列的Ago2突变子使用荧光免疫染色方法来寻找影响Ago2定位于P-Body的关键氨基酸。我们随机得到一个有六个氨基酸发生突变的Ago2突变子,为Ago2-G32W-F128L-R196Q-P458S-T741A-S752G,它完全不在P-Body内定位。这六个氨基酸单点突变子都不能使Ago2完全定位于P-Body之外。相对于其他的五个氨基酸我们发现Ago2上第752位的Ser对于Ago2在P-Body的定位尤为重要。当Ago2第752位Ser突变为Gly时,Ago2在P-body的定位率大大降低。但是单独的第752位Ser突变还不足以使Ago2完全不定位于P-Body之外,实验发现它还需要第32位Gly、128位Phe、458位Pro突变的协助,Ago2四点突变子Ago2-G32W-F128L-P458S-S752G完全不在P-Body中定位。说明四个氨基酸突变的协同作用决定了Ago2不在P-Body内聚集。