论文部分内容阅读
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨退行性变为主要病理特征的慢性关节疾病,是中老年人关节疼痛的最常见原因,其临床早期诊断和防治困难。在OA病因学研究中,OA与代谢综合征(metabolic syndrome,MS)的联系愈来愈受到人们重视。越来越多的学者认为,OA属于MS范畴。英国学者Barker基于大规模流行病学调查结果发现,宫内生长迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)患儿成年后MS的发病率增加,并提出“成人疾病发育起源”假说。近期流行病学资料也显示,男性低出生体重者发生手部OA的比例明显较高,女性也有相似的趋势。另外一项针对低出生体重和腰部OA发病率的流行病学调查也得出了类似的结论。这些研究均提示,OA存在胎儿起源。研究表明,关节软骨的质量高低与OA发生具有明显相关性。关节软骨组织主要形成于胚胎时期,宫内关节软骨发育异常可能是成年OA易感的重要原因之一。有研究表明,软骨胆固醇代谢异常所致的软骨胆固醇蓄积与成年OA的发生关系密切。提示,胎源性OA的发生机制还可能包括关节软骨局部的胆固醇蓄积。已知正常软骨细胞主要通过分泌蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型胶原(ColⅡ)组成细胞外基质,以维持关节软骨的生理功能。转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGFβ)信号通路在软骨细胞的发育分化过程中起到重要作用。TGFβ-Smad2/3是启动软骨基质合成基因转录的关键通路,对于关节软骨发育具有重要意义。研究发现,软骨胆固醇流出通路障碍也参与介导了成人OA软骨胆固醇蓄积的发生。而TGFβ信号通路也可促进胆固醇流出相关基因的表达。咖啡因属黄嘌呤类生物碱,广泛存在于咖啡、茶、软饮料、食品及一些镇痛药物中。大量临床和基础研究已表明,孕期咖啡因暴露(prenatal caffeine exposure,PCE)是导致IUGR的确切和危险诱因之一。本实验室前期系列研究证实,PCE能削弱胎盘糖皮质激素(glucocorticoids,GC)屏障作用,引起胎儿“母源性GC过暴露”,使IUGR胎儿成年后MS易感性增加(包括高胆固醇血症),并存在“神经内分泌代谢编程机制”;我们还发现,PCE可致胎鼠生长板软骨发育迟缓,其机制可能与母源性GC过暴露有关。大量研究已证实,孕期不良环境下出现的母源性高GC与子代宫内编程改变之间存在密切关系。有研究还发现,孕期GC过暴露可抑制胎儿骨骼的纵向生长;高水平GC可导致软骨细胞增殖下降并抑制其基质合成。鉴于上述,那么PCE是否可通过“母源性GC过暴露”导致子代出生后的OA易感性增加?其发生机制是否与软骨TGFβ信号通路和胆固醇流出通路编程改变有关?PCE子代成年后的高胆固醇血症是否加重了 OA易感性增加?这些问题均未见到相关报道。为此,本课题拟进行如下工作:①利用PCE所致子代IUGR模型和关节腔木瓜蛋白酶注射OA模型,证实PCE所致子代软骨胆固醇蓄积和OA易感现象,并在孕 20 天(gestational day 20,GD20),出生后 2 周(postnatal week 2,PW2)、PW6、PW12四个时间点动态观察子代大鼠软骨发育情况;②进一步观察PCE子代软骨TGFβ信号通路和胆固醇流出通路在宫内和出生后不同时间点的变化,探讨PCE子代OA易感的宫内编程机制;③在原代胎鼠软骨细胞上,探讨GC对胎鼠软骨细胞TGFβ信号通路和胆固醇流出通路的作用;④通过给予子代出生后降脂药普伐他汀,探讨高胆固醇血症对软骨基质合成功能的影响。本课题的实施有助于我们更全面的认识PCE子代OA易感现象及其宫内编程机制,更好的理解胎源性OA,也对进一步探索OA的早期预防和治疗方法起到了指导作用。第一部分孕期咖啡因暴露可致子代成年大鼠关节软骨胆固醇蓄积及骨关节炎易感目的:本部分研究拟利用PCE所致子代IUGR大鼠模型和膝关节腔注射木瓜蛋白酶诱导OA模型,观察PCE是否可引起IUGR子代软骨发育不良,及其成年后软骨胆固醇蓄积和OA易感性增加。方法:宫内:Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和小、中、大剂量咖啡因组,即分别为Control、PCE(L)、PCE(M)和PCE(H)组。自GD9起至GD20,咖啡因组分别灌胃给予咖啡因30、60和120mg/kg.d,对照组给予等体积蒸馏水。在GD20时,采用乙醚麻醉孕鼠,剖腹取出胎鼠留取每窝胎仔数为8-14只的母鼠及其胎鼠。记录胎鼠的体重和性别,取胎血和膝关节标本。出生后:PCE(H)组随机留取部分孕鼠让其自然生产,仔鼠按出生后周数(postnatal week,PW)随机分为PW2、PW6和PW12四批,并在相应时间点乙醚麻醉处死,取血和膝关节组织。OA造模:PCE雄性仔鼠(120mg/kg.d)及对照组雄性仔鼠自断奶后,给予正常饮食至8周龄,于PW8时行膝关节腔注射木瓜蛋白酶造OA模型[92],对照组和PCE组大鼠分别于造模开始的第1、4、7、10和13日经左膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液100μl;大鼠右膝于上述时间点注射等量生理盐水。在PW12,经乙醚麻醉处死大鼠,取下肢膝关节。结果:①与对照组相比,PCE组大鼠成年后未接受木瓜蛋白酶刺激时,其关节软骨大体形态较对照组无明显改变;给予木瓜蛋白酶刺激后,PCE组关节软骨行墨汁染色出现肉眼可见的软骨表面尤其是胫骨平台软骨表面严重磨损,关节软骨表面失去光泽并毛糙;②给予木瓜蛋白酶刺激后,行番红O-固绿染色发现,与对照组相比,PCE组出现明显的软骨表面磨损,软骨基质结构紊乱,软骨厚度变薄,基质染色变浅,软骨细胞数明显减少和潮线模糊,且PCE组改良Mankin’s评分较对照组升高更显著(P<0.01);③给予木瓜蛋白酶刺激后,与对照组相比,PCE组软骨总胆固醇含量有明显升高(P<0.05),且软骨Co12al和Aggrecan的mRNA表达亦显著降低(P<0.01);④与对照组相比,PCE组子代软骨在宫内和出生后不同时间点出现不同程度的软骨基质番红O染色减弱,Co12al免疫组化染色变浅,软骨基质合成基因Aggrecan和Co12al的mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论:PCE可致子代胎鼠关节软骨发育不良且可延续至出生后,且成年后软骨出现胆固醇蓄积,在给予膝关节腔注射木瓜蛋白酶刺激后,更易导致OA的发生。第二部分孕期咖啡因暴露致子代大鼠骨关节炎易感的宫内编程机制目的:本部分拟通过整体动物实验,观察PCE子代大鼠在不同发育时期软骨局部TGFβ信号通路和胆固醇流出通路表达,以探讨PCE所致子代大鼠成年软骨胆固醇蓄积和OA易感的可能原因和机制。方法:宫内:Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和小、中、大剂量咖啡因组,即分别为Control、PCE(L)、PCE(M)和PCE(H)组。自GD9起至GD20,分别灌胃给予咖啡因30、60和120mg/kg.d,对照组给予等体积蒸馏水。在GD20时,采用乙醚麻醉孕鼠,剖腹取出胎鼠留取每窝胎仔数为8-14只的母鼠及其胎鼠。记录胎鼠的体重和性别,取胎血和膝关节标本。出生后:PCE(H)组留取部分孕鼠让其自然生产,仔鼠按出生后周数(postnatalweek,PW)随机分为PW2、PW6和PW12四批,并在相应时间点乙醚麻醉处死,取血和膝关节组织。结果:①与对照组相比,PCE组胎鼠体重明显下降(P<0.05,P<0.01),IUGR率显著升高(P<0.01)。同时,PCE组胎血中CORT浓度显著升高(P<0.05,P<0.01);②软骨TGFβ信号通路表达:与对照组相比,PCE组子代在宫内和出生后不同时间点其关节软骨TGFβR Ⅰ、Smad2/3的mRNA和蛋白表达均有不同程度降低(P<0.05,P<0.01);③软骨胆固醇流出通路表达:PCE组子代在宫内和出生后不同时间点其关节软骨LXRa的mRNA和蛋白表达均有不同程度降低(P<0.05,P<0.01),且SR-B1、ABCA1和ABCG1的mRNA也有不同程度降低(P<0.05,P<0.01)。结论:我们发现PCE可能通过母源性GC导致子代软骨局部TGFβ信号通路和胆固醇流出通路的低功能编程,进而导致子代软骨发育不良和胆固醇蓄积。第三部分皮质酮对原代胎鼠软骨细胞基质合成功能的影响及其分子机制目的:本部分拟通过原代大鼠胎软骨细胞,探讨皮质酮(CORT)或咖啡因是否具有直接抑制胎软骨基质合成的作用,证实GC所致的TGFβ通路表达下调是子代软骨基质合成降低的主要机制,并继续深入探讨GC是否可通过TGFβ-Smad2/3调控胆固醇流出通路方法:取GD20大鼠子宫内胎鼠关节软骨组织,分离培养获得原代胎软骨细胞,并进行以下处理:(1)CORT处理:用不同浓度(0、0.35、0.7、1.4、2.8 μM)CORT处理细胞5天、或0.36μM CORT处理细胞不同时间(0、1、3、5、7天)。MTT法检测细胞毒性。选用不同浓度(0、0.35、0.7、1.4 μM)CORT处理细胞5天;给予糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)抑制剂—米非司酮5 μM处理细胞半小时后,再给予1.4μMCORT处理5天;分别给予Smad2/3siRNA和TGFβ1(5 ng/ml)处理1天后,再给予1.4 μM CORT处理5天,实时定量PCR检测细胞外基质合成功能、TGFβ信号通路和胆固醇流出通路的mRNA表达。(2)咖啡因处理:用4 μM咖啡因处理细胞不同时间(0、1、3、5、7天),或不同浓度(0、0.1、1、10、100 μM)咖啡因处理细胞5天,MTT法检测细胞毒性;选用不同浓度(0、0.1、1、10 μM)咖啡因处理细胞5天,实时定量PCR检测细胞外基质合成功能、TGFβ信号通路和胆固醇流出通路的mRNA表达。结果:(1)皮质酮作用:①0.35μMCORT给药1～5d后活细胞数量无明显改变,但给药 7d,活细胞数量显著下降(P<0.05);CORT(0、0.35、0.7、1.4、2.8μM)处理细胞5天后,2.8μMCOTR浓度组活细胞数量显著降低(P<0.05);②与对照组相比,CORT处理组细胞TGFβ信号通路、胆固醇流出通路和基质合成基因的mRNA表达基本呈浓度依赖性降低(P<0.05,P<0.01),而给予米非司酮处理后可逆转上述抑制作用;③与1.4μM CORT组相比,Smad2/3 siRNA +1.4μM CORT组LXRa的mRNA无明显差异,且基质合成基因mRNA表达亦无明显改变。在给予TGFβ1处理细胞后,与Smad2/3 siRNA组相比,TGFβ1+1.4μM CORT组的Smad2、Smad3和LXRa的mRNA表达均显著升高(P<0.01),且基质合成基因mRNA表达亦显著升高(P<0.01)。(2)咖啡因作用:①与对照组相比,咖啡因组给药1d后活细胞数量显著增加(P<0.01),但给药7 d后细胞数显著下降(P<0.01);咖啡因(0、0.1、1、10、100 μM)处理细胞5天后,100 μM咖啡因浓度组的细胞数显著降低(P<0.01);②与对照组相比,咖啡因处理组TGFβ信号通路和胆固醇通路相关基因的mRNA表达未发生一致性改变,但基质合成基因的mRNA表达呈浓度依赖性降低(P<0.01)。结论:本部分研究证实了皮质酮能直接抑制胎软骨细胞外基质合成功能,其机制与GC通过TGFβ-Smad2/3调控胆固醇流出通路有关;此外,咖啡因也可直接抑制胎软骨细胞外基质合成功能,但其机制仍需进一步研究。第四部分孕期咖啡因暴露子代大鼠出生后高胆固醇血症加重软骨胆固醇蓄积目的:本部分拟通过整体动物实验给予降脂药普伐他汀,并通过提取PW6子代大鼠软骨细胞给予外源性胆固醇,观察高胆固醇血症对子代大鼠软骨质量以及胆固醇流出通路的影响,并探讨其可能的原因和机制。方法:Wistar母鼠自然受孕后,随机分为对照组和PCE组。自GD9起至GD20,分别灌胃给予咖啡因120mg/kg.d,对照组给予等体积蒸馏水。待孕鼠自然生产后,PCE雄性仔鼠及对照组雄性仔鼠自PW4断奶后,部分雄性仔鼠给予正常饮食至6周龄,取血及其膝关节原代软骨细胞。其余雄性仔鼠给予正常饮食至8周龄,于PW8时行普伐他汀(20mg/kg.d)或等体积生理盐水灌胃处理至PW12。即随机将对照组和PCE组大鼠分为对照+生理盐水组、对照+普伐他汀组、PCE+生理盐水组和PCE+普伐他汀组。在PW12,经乙醚麻醉处死大鼠,取血及双侧下肢膝关节,待行后续指标检测。结果:①在生理盐水灌胃组,与对照组相比,PCE组血总胆固醇(TCH)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平较对照组均显著升高(P<0.01),且PCE组软骨局部TCH含量较对照组显著升高(P<0.05);而在普伐他汀组,PCE组血TCH、HDL-C和LDL-C水平较对照组均无明显改变,且PCE组软骨局部TCH含量较对照组亦无明显改变;②在生理盐水组,PCE组软骨胆固醇流出通路LXRa、SR-B1、ABCA1的mRNA表达较对照组均显著降低(P<0.05,P<0.01),且PCE组软骨Co12al和Aggrecan的mRNA表达也较对照组显著降低(P<0.05,P<0.01);而在普伐他汀组,PCE组软骨胆固醇流出通路LXRa、ABCA1和ABCG1的mRNA表达较对照组无明显改变(P>0.05,图4-2A、C、D),但SR-B1仍显著降低(P<0.01),而PCE组软骨Co12al和Aggrecan较对照组也无明显改变(P>0.05);③在PW6时,PCE组血TCH、HDL-C和LDL-C浓度较对照组并无显著差异(P>0.05);在PW6子代大鼠软骨细胞,随着给予外源性胆固醇浓度的升高,PCE组胆固醇流出通路(LXRa、SR-B1 和 ABCA1)和基质合成(Co12al 和 Aggrecan)的 mRNA表达较对照组降低程度也更明显(P<0.05,P<0.01)。结论:PCE可致成年子代大鼠高胆固醇血症,而后者可能通过进一步抑制子代大鼠软骨胆固醇流出通路,从而加重软骨局部胆固醇蓄积。此外,他汀类药物可能通过改善软骨局部胆固醇流出通路抑制,从而减轻软骨局部胆固醇蓄积。