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2009年4月，全球性范围内爆发的甲型H1N1流感病毒疫情对如何快速制备新型传染性疾病疫苗应对突发性病毒性传染病提出挑战。世界卫生组织提供的2009甲型H1N1流感病毒疫苗株在鸡胚内繁殖效率较低，仅仅为常规季节性流感病毒疫苗的1/5到1/10。加上海兰鸡胚供应紧张，造成我国乃至全球甲流感疫苗生产能力不足。鸡胚生产的传统灭活减毒疫苗无法对鸡蛋过敏者适用，病毒裂解试剂和残留病毒基因组具有潜在风险，因此发展新型安全病毒疫苗势在必行。 病毒样颗粒(VLPs)通常由病毒结构蛋白自我组装形成，不包含病毒基因组，其形态构相和真实病毒颗粒非常接近。因此这种无感染性的缺乏核酸物质的VLPs大分子聚合体因其高效和安全性正成为一种高效安全的新型候选疫苗。与传统鸡胚生产的减毒或者灭活病毒疫苗不同的是，VLPs在高效诱发细胞和体液免疫同时，不存在有病毒未完全灭活，病毒复活甚至成为强毒株，病毒基因组交换重组等潜在风险。病毒样颗粒疫苗为因其安全与全价免疫效果而具有很好的发展前景。流感病毒VLPs能够在昆虫细胞内表达和装配。然而传统实验室表达系统生产成本极高，装配效率低下。使用具有自主知识产权的多基因表达家蚕生物反应器来生产甲型H1N1流感病毒样颗粒。通过改进的表达系统，可以提高三个基因的表达量和装配效率。该系统可克隆多达4倍拷贝数目的基因使得表达和装配效率达到最高。所制备的病毒样颗粒对发展新型病毒疫苗具有重要意义。 为了研究H1N1 VLPs在昆虫细胞和家蚕体内的组装，本研究用RT-PCR方法克隆得到A/Nanyang/2009(H1N1)病毒的M1(基质蛋白)、NA(神经氨酸酶)和HA(血凝素蛋白)三个结构基因。同时，为了研究基因拷贝数对VLPs产量的影响，分别构建含有一个拷贝数的M1、NA、HA基因和两个拷贝数的M1、NA、HA基因的转移载体，载体中含有绿色荧光蛋白的报告基因。本研究采用细菌间结合转移同源重组，Tn7转座方式与cre-loxp位点特性重组三种方法，分别将转移载体携带的甲流结构基因转座到AcMultiBac和本研究构建的BmMulfiBac-Gm病毒基因组，分别获得重组病毒。由于重组病毒的构建都是在asd基因缺失型多功能宿主菌中完成的，直接将含有三个基因的AcMultiBac重组病毒菌液感染sf9细胞，三天后可以观察到绿色荧光。收集病毒液上清，在盲传三代病毒，感染大规模培养的Sf9细胞，三天后收集细胞上清。 同时，本研究将含有三个基因的BmMultiBac-Gm重组病毒菌液用无菌水洗涤掉DAP后注射五龄家蚕，5天后可见到明显的荧光，收集家蚕血淋巴细胞，低速离心去掉杂质。高速离心浓缩收集的细胞上清和家蚕血淋巴细胞细胞中的VLPs，离心沉淀用PBS重悬放4℃过夜，后用20％-30％-60％蔗糖梯度离心纯化。纯化的VLPs用特异性的M1、NA和HA鼠单抗和山羊抗鼠的二抗，western blotting可以检测M1、NA和HA蛋白的表达。将纯化的VLPs，电子显微镜观察可见到大小80-120nm的H1N1VLPs。这说明，M1、NA和HA基因在昆虫细胞和家蚕体内得到了很好地表达，同时能够组装成VLPs，这进一步说明了，本研究构建的家蚕生物反应器能够很好地表达外源基因。