家蝇对镉、锌胁迫的响应及其对土壤镉、锌污染的规避

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目的:(1)了解家蝇幼虫对Cd、Zn胁迫的响应。(2)了解家蝇代谢残渣对Cd、Zn污染土壤的影响。  方法:1 Cd、Zn胁迫家蝇幼虫实验:分别以0(对照)、1、20、70、250 mg/kg含镉人工饲料、500、1000、5000、10000 mg/kg含锌人工饲料喂饲一日龄家蝇幼虫48 h,每组(含300 g干麦麸)喂饲900头1日龄家蝇幼虫,建立Cd、Zn胁迫家蝇一日龄幼虫48小时动物模型。测定家蝇三日龄幼虫体重、体长,观察蛹的羽化率及成虫寿命;提取家蝇三日龄幼虫血淋巴,原子吸收分光光度计测定血淋巴镉、锌含量,蒽酮测定比色法血淋巴的总糖含量、考马斯亮蓝法测定血淋巴的蛋白质含量、磷酸香草醛显色反应法测定血淋巴的脂肪含量,氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量;实时荧光定量PCR技术测定三日龄幼虫抗逆相关基因ATP合酶、精氨酸激酶、金属硫蛋白、ABC膜转运蛋白、MAF-1、超氧化物歧化酶、铁蛋白的mRNA水平。2 Cd、Zn污染环境下家蝇规避重金属危害的实验:(1)盆栽菠菜试验共设(空白+5%同步发酵底料)、(空白+5%家蝇代谢残渣)、50mg/kg Cd、(50mg/kg Cd+5%家蝇代谢残渣)、100mg/kg Cd、(100mg/kg Cd+5%家蝇代谢残渣)、500mg/kg Zn、(500mg/kg Zn+5%家蝇代谢残渣)、1000 mg/kg Zn、(1000mg/kg Zn+5%家蝇代谢残渣)10个处理组。菠菜收获后,测定菠菜的生物量,ICP-OES测定土壤有效镉、有效锌及菠菜镉、锌含量的影响,磷脂脂肪酸(PLFA)法测定土壤微生物多样性,Elisa法测定土壤磷酸酶、转化酶、纤维素酶、脱氢酶、脲酶。(2)家蝇代谢残渣中甲壳素的提取及鉴定8%NaOH脱蛋白(80℃,3h)→1%KMnO4、1%草酸脱色(数小时)→2mol/L盐酸脱无机盐等杂质的方法提取家蝇代谢残渣中甲壳素,KBr压片红外光谱法验证提取物。(3)抑菌实验采用多孔板-微量液体法测定家蝇幼虫分泌物粗提液(幼虫活体浸泡法获得,蛋白含量169.1ug/ml)和不同浓度蛆皮壳聚糖(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/ml)对重金属有效性相关四株菌短小芽孢杆菌、黄色短杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的抑制效果。  结果:1家蝇幼虫在Cd、Zn胁迫下的指标结果(1)生长发育、繁殖和寿命与对照组比较:70、250mg/kgCd胁迫组和1000、5000、10000mg/kg Zn胁迫组体重明显降低;250mg/kgCd胁迫组和5000、10000mg/kg Zn胁迫组体长明显降低;1、20、70、250 mg/kg镉暴露组家蝇蛹羽化率明显降低;500、1000、5000、10000mg/kgZn胁迫组和1、20、70、250 mg/kg镉暴露组家蝇成虫寿命明显缩短,250 mg/kg镉暴露组家蝇成虫寿命明显短于其余各染镉组。Cd、Zn与家蝇三日龄幼虫体长、体重、蛹的羽化率均呈负相关;Cd与家蝇成虫寿命呈负相关。(2)血淋巴Cd、Zn含量20、70、250mg/kgCd胁迫组家蝇幼虫血淋巴Cd含量明显升高,Cd250组>Cd70组>Cd20组>Cd1组;Zn胁迫各组家蝇幼虫血淋巴Zn含量明显升高,Zn10000组>Zn5000组>Zn1000组>Zn500组。(3)血淋巴能量物质含量1、20、70 mg/kgCd胁迫组和500、1000mg/kg Zn胁迫组三日龄幼虫血淋巴总糖明显降低;1、70、250 mg/kg Cd胁迫组和Zn胁迫各组三日龄幼虫血淋巴脂肪的含量明显降低;除20mg/kgCd胁迫组以外,各胁迫组血淋巴蛋白含量明显降低;Cd、Zn胁迫各组三日龄幼虫血淋巴热量值明显下降。Cd、Zn与家蝇三日龄幼虫血淋巴蛋白、脂肪、热量值均呈负相关;Zn与家蝇三日龄幼虫血淋巴总糖呈负相关。(4)血淋游离巴氨基酸含量1、20mg/kg Cd胁迫组家蝇3日龄幼虫血淋巴生糖氨基酸浓度明显降低,1、70、250mg/kg Cd胁迫组家蝇3日龄幼虫血淋巴生酮氨基酸浓度明显升高,1、20mg/kg Cd胁迫组家蝇3日龄幼虫血淋巴生糖兼生酮氨基酸浓度分别明显升高、降低;1000 Zn胁迫组家蝇3日龄幼虫血淋巴生糖氨基酸浓度明显降低,5000、10000mg/kg Zn胁迫组家蝇3日龄幼虫血淋巴生糖、生酮、生糖兼生酮氨基酸浓度及游离氨基酸总量均明显降低。Cd与家蝇3日龄幼虫血淋巴游离氨基酸总量、生糖氨基酸、Gly、Pro呈均正相关,Zn与家蝇3日龄幼虫血淋巴游离氨基酸总量、生糖氨基酸、生酮氨基酸、生糖兼生酮氨基酸、Thr、Ser、Ala、 Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Arg均呈负相关,与Glu呈正相关。(5)抗逆相关基因mRNA水平 Zn、Cd胁迫各组ATP合酶、金属硫蛋白mRNA表达量均分别明显升高;5000mg/kg Zn胁迫组和20mg/kg Cd胁迫组精氨酸激酶、MAF-1的mRNA表达量分别明显升高;500、1000、10000mg/kg Zn胁迫组和1、20、250mg/kg Cd胁迫组ABC转运蛋白mRNA表达量明显升高;500mg/kg Zn胁迫组铁蛋白mRNA表达量明显升高;500、1000、5000mg/kg Zn胁迫组和Cd胁迫各组超氧化物歧化酶均明显升高。此外,主成分分析结果表明,家蝇响应Cd胁迫起主要作用的指标贡献从大到小依次为Cys、Met、Phe、Ser、Pro、Asp、Tyr、Arg、Thr、Leu、Lys、Ala、Val、His、血淋巴镉浓度、Glu、Ile;响应Zn胁迫起主要作用的指标贡献从大到小依次为Ser、Tyr、Ile、Met、Cys、Leu、Phe、Ala、Val、血淋巴锌浓度、Glu、Gly、Arg、Thr、His、Pro、Asp。2 Cd、Zn污染环境下家蝇规避重金属危害的实验结果(1)盆栽实验结果①土壤Cd、Zn有效性 Cd或Zn剂量相同时、加家蝇代谢残渣组土壤有效Cd或Zn含量均明显低于未加家蝇代谢残渣组。②菠菜干重及Cd、Zn含量 Cd剂量相同、加家蝇代谢残渣与否的两组间比较,加家蝇代谢残渣组菠菜地下部分镉含量较未加家蝇代谢残渣组明显降低;50mg/kg Cd组菠菜地上部分镉含量较(空白+同步发酵底料)和(空白+家蝇代谢残渣)组明显升高,但(50mg/kgCd+家蝇代谢残渣)组无统计学意义。Zn剂量相同、加家蝇代谢残渣与否的两组间比较,(500mg/kgZn+家蝇代谢残渣)组菠菜地上部分Zn含量较500mg/kgZn组明显降低;加家蝇代谢残渣组菠菜地下部分Zn含量较未加家蝇代谢残渣组明显降低有统计意义;加家蝇代谢残渣组菠菜地上部分干重较未加家蝇代谢残渣组明显升高;与(空白+5%同步发酵底料)组比较,1000mg/kg单纯加Zn组菠菜地上部分干重明显降低,但(1000mg/kg Zn+家蝇代谢残渣)组差异无统计学意义。③土壤生物活性 I土壤微生物种群结构(a)多样性指数结果:与(空白+同步发酵底料)比较,100mg/kg Cd污染组Shannon、Brillouin降低有统计学意义(P<0.05),但(100mg/kg Cd+家蝇代谢残渣)组差异无统计学意义;50mg/kg Cd组McIntosh指数降低有统计学意义(P<0.05或0.01),但(50mg/kg Cd+家蝇幼虫代谢残渣)污染组差异无统计学意义。(b)不同微生物类群的代表性特征脂肪酸结果:加家蝇代谢残渣组10Me16:0相对生物量较单纯镉污染各组明显升高;(50mg/kg Cd+家蝇代谢残渣)脂肪酸16:1ω5c相对生物量较50mg/kg Cd污染组明显升高;与(空白+同步发酵底料)比较,100mg/kg单纯Cd污染组16:1ω5c相对生物量明显降低,但(100mg/kgCd+家蝇代谢残渣)组差异无统计学意义;与(空白+家蝇代谢残渣)比较,50 mg/kg单纯Cd污染组16:1ω5c相对生物量明显降低,但(50mg/kgCd+家蝇代谢残渣)组差异无统计学意义。II土壤酶活性与(空白+同步发酵麦麸)组比较,100mg/kg单纯Cd组磷酸酶明显降低,但(100mg/kg Cd+家蝇代谢残渣)组差异无统计学意义。与(空白+5%家蝇代谢残渣)组比较,500mg/kg Zn组磷酸酶明显降低,但(500mg/kg Zn+家蝇代谢残渣)组差异无统计学意义;1000mg/kg Zn组纤维素酶、脲酶明显降低,但(1000mg/kg Zn+家蝇代谢残渣)组差异无统计学意义。(2)甲壳素提取及鉴定结果红外光谱图证实从养蝇残渣中提取到甲壳素或壳聚糖;(3)抑菌试验结果蝇蛆壳聚糖对黄色短杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的IC50分别为0.198、0.149、0.183、0.209mg/mL;蛋白含量为169.1ug/ml的家蝇分泌物粗提液对黄色短杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的抑制率(%)分别为:5.49、4.84、4.96、9.82。  结论:(1)家蝇凭借体格变小、能耗增多、氨基酸代谢库变化、金属转运、免疫、抗氧化等防御Cd、Zn胁迫;可监测环境Cd、Zn污染。(2)家蝇凭借代谢物中甲壳素或壳聚糖、分泌物等抑制黄色短杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和增加硫酸原还原菌等以降低土壤Cd、Zn生物有效性;可改善菠菜品质。
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