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目的:卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤。卵巢癌患者微环境中存在的大量免疫抑制分子抑制了树突状细胞(dendritic cell,DC)的功能,使机体免疫系统对肿瘤细胞无法识别,导致了肿瘤细胞的增殖和转移。目前研究表明,以DC为基础的免疫基因治疗是通过增强机体免疫系统功能发挥抗肿瘤作用,这使其成为一种新型的肿瘤生物治疗方法,越来越受到人们的重视。CD40L与DC表面CD40相互作用在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。可溶性CD40配体(soluble CD40 ligand,sCD40L)是由膜型CD40L水解形成,保留了CD40L的生物学特性。本课题旨在研究卵巢癌患者微环境中免疫抑制分子的表达水平及sCD40L联合多种细胞因子诱导DC后其生物学活性和功能的改变,初步探讨DC刺激T细胞后生成的CTL对人卵巢癌细胞SKOV3的增殖抑制及其作用机制,为sCD40L应用于临床免疫治疗提供依据。方法:1应用半定量RT-PCR法检测卵巢癌患者外周血中免疫抑制分子IL-10和TGF-βmRNA的表达水平。2 sCD40L刺激脐血来源DC后,DC表型和分泌细胞因子的情况应用倒置显微镜观察DC形态学变化;分别用流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测sCD40L作用前后DC表面CD80、CD86的表达;用半定量RT-PCR法检测sCD40L作用前后DC分泌的细胞因子IL-23、IL-27、IL-10、TGF-β,Th0向Th1方向分化途径中转录因子STAT4、T-bet及趋化因子受体CCR7 mRNA的表达;用ELISA法检测DC培养上清中TNF-α和IL-23的含量。3 sCD40L刺激DC前后对T细胞增殖能力和杀伤活性影响的测定用MTT法检测sCD40L作用前后DC刺激T淋巴细胞的增殖能力;用半定量RT-PCR法检测sCD40L作用前后DC与T淋巴细胞共培养后IFN-γ分泌水平;用MTT法检测sCD40L作用前后经冻融抗原致敏的DC刺激生成的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对人卵巢癌细胞SKOV3体外增殖作用的影响。结果:1卵巢癌患者外周血中免疫抑制分子IL-10和TGF-βmRNA的表达,与对照组妇科良性肿瘤患者中的表达相比显著升高( P<0.05)。2镜下观察,GM-CSF+IL-4+SCF+Flt-3l+TNF-α组和GM-CSF+IL-4+SCF+ Flt-3l+sCD40L组诱导的成熟DC数量较GM-CSF+IL-4组和GM-CSF+ IL-4+TNF-α组明显增多,并且细胞体积大,细胞表面毛刺状突起较明显;流式细胞术检测发现,经sCD40L作用后DC表面CD80、CD86分子表达水平,与未经sCD40L作用组DC相比明显增加,差异有显著性(P<0.05);激光共聚焦显微镜下可观察到sCD40L作用后DC表面CD80、CD86分子荧光强度表达升高(P<0.05);半定量RT-PCR法检测发现,经sCD40L刺激成熟的DC分泌的细胞因子IL-23、IL-27、STAT4、T-bet及CCR7 mRNA表达水平显著增加,与未经sCD40L作用组DC相比差异有显著性(P<0.05);sCD40L诱导的成熟DC培养上清中TNF-α和IL-23的含量高于未经sCD40L作用组(P<0.05);而DC分泌的免疫抑制因子IL-10和TGF-βmRNA表达水平则明显降低(P<0.05)。3 sCD40L诱导的DC与T淋巴细胞共培养后能分泌高水平的细胞因子IFN-γ;DC与T细胞按1:10比例混合培养时,刺激指数最大,DC刺激T淋巴细胞增殖能力最强,与其他组相比有显著性差异(P<0.05);经sCD40L作用后的抗原致敏组DC刺激生成的CTL对人卵巢癌细胞株SKOV3有明显的杀伤作用,并且在不同效靶比10:1、20:1、40:1作用时,CTL对SKOV3细胞的杀伤率随效靶比的增加而增强,与未经sCD40L作用的抗原致敏组和单独T细胞组相比均有显著性差异(P<0.05)。结论:1卵巢癌患者微环境中存在着免疫抑制因子,抑制了患者免疫功能。2 sCD40L是有效促进DC成熟的细胞因子之一,上调了DC表面CD80、CD86分子的表达;与细胞因子SCF、Flt-3l联合应用后能促使细胞体积增大,胞体表面突起增多。3 sCD40L能提高抗原致敏的DC激发T细胞产生特异性抗肿瘤免疫反应的能力,其作用机制可能与sCD40L与DC表面CD40相互结合,促进DC高分泌Th1型细胞因子IL-23、IL-27、TNF-α,抑制免疫抑制分子IL-10、TGF-β的分泌,通过STAT4/T-bet途径激活初始T细胞向Th1方向分化,促使Th1分泌IFN-γ能力增强,从而引发细胞细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤卵巢癌细胞有关。