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甜玉米籽粒的类胡萝卜素组分中的β-隐黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素能在人体内转变为维生素A,被称为维生素A源,在三大禾谷类作物中,唯有玉米籽粒含有维生素A源。维生素E具有很强的生物活性,是最主要的抗氧化剂之一,天然存在的维生素E有多种同系物,玉米籽粒中主要的维生素E同系物有α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。维生素含量是评价甜玉米营养品质的重要指标之一。本实验针对我国甜玉米营养品质研究空白,以47份甜玉米自交系及2份甜玉米品种为材料,采用高效液相色谱法(HPLC)对甜玉米籽粒维生素A源和维生素E的含量水平、积累过程进行了系统的研究,并进一步对47份甜玉米自交系材料的维生素A源代谢过程中的重要基因LCYE的等位基因变异进行了研究。同时利用分子标记辅助育种技术,将普通玉米材料中的有利基因型导入三个甜玉米自交系,快速得到维生素A源含量较高的甜玉米材料。主要结果如下:
1.测定的47份甜玉米自交系的维生素A源物质:α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、玉米黄质、叶黄素的含量变化范围分别是:0.03-3.85μg/g、0.04-4.49μg/g、0.08-35.48μg/g、0.31-19.07μg/g、0.99-43.52μg/g,维生素A源总含量的变化范围为0.07-22.76μg/g,平均值为3.28μg/g,变异系数达1.44;维生素E成分:α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的含量变化范围依次是:1.69-58.03μg/g、3.61-68.80μg/g、0-2.66μg/g,维生素E总含量的变化范围为18.50-99.17μg/g,平均值为51.15μg/g,变异系数为0.35;不同甜玉米自交系的维生素A源和维生素E含量差异极显著,有可能选育出维生素A源和维生素E含量较高的甜玉米品种。
2.从以上材料中选取了8个具有代表性的甜玉米自交系和2个杂交种,共计10份材料,于授粉后15天、18天、21天、24天、27天、30天分六个时期采摘果穗,分析籽粒中维生素A源和维生素E的含量变化规律。结果显示,在授粉后15天,维生素A源和维生素E就已经在籽粒中积累,各组分的最大含量出现在不同时期,说明材料间维生素A源和维生素E的代谢和累积过程有差异。70%的材料维生素A源含量最高值出现在21天~27天,不同材料各组分占维生素A源总含量的比例差异较大。维生素E总含量的最大值集中出现在21天以后,50%的材料的维生素E总含量出现在21天~27天,不同材料的维生素E总含量随时间变化的趋势有差异,维生素E总含量的变化趋势与γ-生育酚组分一致,这主要因为γ-生育酚在维生素E总含量中所占比值超过50%。维生素A源和维生素E累积规律的研究对确定甜玉米的最佳采收期具有指导意义。
3.LCYE、HYDB1和PSY1基因是维生素A源代谢过程中的关键基因,利用已开发的这三个基因的功能分子标记对所有自交系材料进行单倍型分析,结果显示,在甜玉米自交系材料中Indel1、5'indel/3'indel、D4位点是最有利的单倍型组合,这与前人研究结果并不完全相同。需对甜玉米自交系材料的关键基因做更深入的等位基因分析。随后对47份甜玉米自交系材料的LCYE基因测序,共检测到75个多态性位点,其中26个多态性位点分布在基因的10个外显子区,均为SNP,平均每60bp检测到一个,第五外显子区多态性位点最丰富,有8个SNP位点,平均每18bp检测到一个,第四和第九外显子无多态性位点,保守程度较高。49个多态性位点分布在非编码区,检测到的所有13个Indel位点均分布在非编码区,其中6个Indel的插入与相邻序列相同,实质上是多了一个拷贝,Indel片段的长度从1~40bp,多数在4~8bp之间。本研究结合已测定的维生素A源表型值和本实验室利用SSR标记所做的群体结构,做了外显子区检测到的多态性位点与维生素A源性状的关联分析。结果显示:有7个多态性位点与维生素A源及β-胡萝卜素这两种表型有显著关联。与维生素A源总含量关联的多态性位点有6个,与β-胡萝卜素相关联的位点有3个。有两个位点与这两种表型均存在显著关联。多态性位点exon1-2与两种表型的关联达到极显著水平。exon1-2和exon5-6位点与维生素A源表型关联程度较高,且同时与维生素A源总含量和β-胡萝卜素关联,能在一定程度上反应表型性状,为今后的维生素A源强化育种提供理论基础。
4.利用前人开发的的功能分子标记将普通玉米中LCYE和HYDB1基因的有利基因型导入A12、A28和A46三个甜玉米自交系中。得到背景回复较好的BC1F1代,三个导入目标片段的受体群体的BC1F1维生素A源含量比无目标片段的BC1F1分别提高了3.23μg/g、7.71μg/g、2.95μg/g。由于自交系A28为白色玉米,所以含量提高幅度最大,排除A28,维生素A源含量平均提高了74.08%(3.09μg/g)。用筛选出的89个亲本间有多态性的SSR标记对BC1F1进行背景回复率的分析,结果显示,三个群体的背景回复率平均值为72.83%,最低的51.34%最高的达85.71%。三个群体多数后代的背景回复率集中在60~70%之间,背景回复率超过80%的共有10株,占总群体的2.9%。得到的优良单株将作为中间材料继续应用于以后的高维A和高维E的甜玉米育种中。