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番木瓜(Caricapapaya L.),又称木瓜,是热带和亚热带地区广泛种植的一种重要经济作物。而番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是限制番木瓜产业发展的主要因子,可导致番木瓜严重减产和品质降低,甚至完全绝收。转PRSV复制酶基因(replicase gene,rep)番木瓜——"华农1号"的获得从根本上解决了华南地区番木瓜生产上的关键问题,因此在华南地区得到了广泛种植并被商品化生产。但目前商品化的转基因番木瓜"华农1号"既含有目的基因rep又含有选择标记基因——卡那霉素抗性基因(neomycin phosphotransferasⅡ gene,nptⅡ),而从食品安全和生态环境的角度考虑,所培育的转基因作物最好均不含选择标记基因。本研究选择在田间种植10多年的转复制酶基因番木瓜植株"华农1号"作为研究对象,一方面筛选获得rep表达正常而nptⅡ表达异常的转基因植株,另一方面研究转基因植株中nptⅡ基因表达和变异情况以及nptⅡ蛋白表达对植物体内微生物的影响,从而为进一步培育含有目的基因但不含标记基因的转基因番木瓜材料提供前提和基础。
选择在田间表现高度抗病性的"华农1号"番木瓜植株,首先采用PCR方法确定了含有rep基因完整的305个植株,对这些植株分别采用DAS-ELISA、PCR、RT-PCR及Southem印迹杂交的方法对标记基因nptⅡ进行筛选和鉴定,筛选到5株rep表达正常、而nptⅡ蛋白表达呈阴性的转基因番木瓜植株。
针对nptⅡ蛋白表达呈阴性的5株植株,设计不同的特异性引物分别进行PCR及RT-PCR扩增,扩增片段的序列分析结果表明,在这5株变异植株中,有3株在nptⅡ基因区发生了点突变而导致蛋白翻译终止密码子的提前产生,1株在nptⅡ基因的P-Nos启动子区域的"CAAT框"遭到破坏而不能进行正常转录,还有1株证实其整个nptⅡ基因表达框完全缺失。
通过对nptⅡ蛋白表达呈阴性和nptⅡ蛋白正常表达的转基因番木瓜植株根、茎、叶部位的体内微生物进行菌落培养和Biolog ECO方法的检测,结果发现,nptⅡ蛋白表达呈阴性的转基因植株与nptⅡ蛋白正常表达的植株相比较,不仅其体内微生物总体含量比较高,体内微生物对碳源的利用能力相对较强,而且其微生物群落的丰富度和均匀度也相对较高。
含有番木瓜环斑病毒(PRSV)的rep和标记基因nptⅡ的转基因番木瓜"华农1号"已经被商品化并在广东广泛种植10余年,开展外源标记基因的变异研究以及获得含有正常的靶标目的基因但标记基因突变的转基因番木瓜基础材料,在转基因番木瓜研究中具有重要的理论意义和实践价值。这是对转基因番木瓜中标记基因变异的首次报道。