硫酸镁对6-羟基多巴胺损伤的未分化及分化SH-SY5Y细胞保护作用的比较及机制研究

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目的:  1.比较MgSO4对6-OHDA损毁的未分化及分化SH-SY5Y细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)代谢、总抗氧化能力的改变以及保护作用的差异。  2.探究未分化SH-SY5Y细胞和分化 SH-SY5Y细胞酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)在细胞内的表达变化。  方法:  1.以适当浓度的6-OHDA损毁SH-SY5Y构建帕金森病(Parkinsons Desease,PD)细胞模型。  2.用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测分化的SH-SY5Y细胞对不同浓度6-OHDA的敏感性(未分化组采用实验室的前期使用浓度)。  3.用CCK-8试剂盒比较不同浓度的MgSO4对6-OHDA损毁的未分化及分化SH-SY5Y细胞存活率的影响。  4.培养SH-SY5Y细胞,未分化组随机分为对照组、6-OHDA损毁组和MgSO4处理组,对照组加等体积溶剂,6-OHDA损毁组加入50μM6-OHDA孵育24h,MgSO4处理组在损毁前1h分别加入0.25mM、0.5mM、1mM MgSO4。分化组加入全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)诱导分化72h后,随机分为对照组、6-OHDA损毁组和MgSO4处理组,对照组加等体积溶剂,6-OHDA损毁组加入200μM6-OHDA孵育24h,MgSO4处理组在损毁前1h分别加入0.25mM、0.5mM、1mM、2 mM、5 mM MgSO4。  5.细胞免疫荧光染色,观察未分化SH-SY5Y细胞和分化SH-SY5Y细胞中TH的表达情况。  6.2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)测定细胞总抗氧化能力在上述处理后的变化。  7.利用荧光探针2’7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)测定细胞内ROS代谢情况在上述处理后的变化。  结果:  1.分化的SH-SY5Y细胞的CCK-8结果显示,与对照组相比,50μM~200μM6-OHDA损毁细胞24h均可降低分化的SH-SY5Y细胞的存活率(p<0.05),其中,200μM的6-OHDA可使细胞存活率下降56.54%(P<0.05)。  2.无论未分化或分化组,损毁前添加不同浓度的MgSO4均可提高6-OHDA损伤细胞的存活率(p<0.05)。其中,未分化组6-OHDA损伤浓度为50μM,MgSO4最佳保护浓度为0.5mM。分化组6-OHDA损伤浓度为200μM,MgSO4的保护能力则随着浓度的增加而升高。提示不同分化状态的SH-SY5Y细胞对6-OHDA和MgSO4的敏感性存在差异。  3.分化SH-SY5Y细胞中TH表达程度明显高于未分化SH-SY5Y细胞。  4.细胞总抗氧化能力和ROS测定结果显示,无论未分化或分化组,6-OHDA均可降低细胞总抗氧化能力(p<0.05),并使细胞内产生大量ROS,而MgSO4可增强损毁细胞的总抗氧化能力,并抑制其ROS的产生。但是MgSO4对未分化和分化组的最佳保护浓度和趋势存在差异,提示MgSO4的保护作用可能与SH-SY5Y细胞是否分化状态有关。  结论:MgSO4对6-OHDA损伤的未分化及分化的SH-SY5Y细胞均有一定的保护作用,但其保护的效果可能与SH-SY5Y细胞分化状态相关。
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