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家蚕(Bombyx mori)是卵滞育性鳞翅目模式昆虫,其滞育卵的活化与滞育发育时间间隔测定酶酯酶A4密切相关。TIME-EA4具备稳定的Cu／Zn SOD活性和只在卵滞育末期出现的生物钟测时功能瞬时酯酶ATPase活性。昼夜节律是最普遍的生物节律现象,受遗传生物钟基因调控,而家蚕的卵滞育是其对昼夜节律授时因子(温度和光照等)响应的一种现象,这为我们研究家蚕昼夜节律生物钟基因提供了一个很好的参照。为了深入研究家蚕TIME-EA4的分子作用机制,本文首先从蛋白质分子进化角度研究了TIME-EA4双重酶活性的发生机制；同时为了进一步研究TIME-EA4生物测时与昼夜节律生物钟信号途径的关系,本文克隆、分析和初步整合了家蚕昼夜节律生物钟基因反馈环路。
本文首先克隆了17个物种的Time-ea4同源基因Time-likes,从NCBI中获得17-20个物种的Cu／Zn SOD、羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶蛋白序列,通过比对、MOTIFS、进化踪迹、位点扫描、聚类等方法系统的分析了TIME-EA4的分子进化。同时,通过RT-PCR和RACE方法克隆了家蚕昼夜节律生物钟基因Bmcry1与Bmcry2的全长cDNA序列,电子克隆(in silico cloning)了Bmvri,Bmcyc,Bmtim2,Bmpdp完整的ORF序列,以及Bmclk基因的ORF片段。在此基础上,对上述基因及其表达产物进行了结构分析、染色体定位和系统的分子进化分析,最后根据这些基因及其表达产物的结构特征结合现有的数据资源,初步整合了家蚕昼夜节律生物钟反馈环路。结果如下：
⑴家蚕TIME-EA4起源于Cu／Zn SOD。家蚕TIME-EA4及多物种中其同源蛋白(TIME-Iikes)都与Cu／Zn SOD的序列相似性较高(33％～100％),属于Cu／Zn SOD超家族,都具有Cu／Zn SOD特征序列(SOD_CU_ZN_1和SOD_CU_ZN_2motifs)。TIME-EA4具有稳定的Cu／ZnSOD活性和Cu／Zn离子结合位点,进化踪迹分析显示TME-EA4的重要氨基酸残基(coverage<25％)的91.2％都用来维持与Cu／Zn SOD的序列一致性。在选取的非昆虫物种中,TIME-like就是该物种的Cu／Zn SOD,而在一些昆虫物种中TIME-like是有别于Cu／Zn SOD蛋白。根据进化史,自从有光合生物,就有Cu／ZnSOD的结论,本文仅在昆虫中找到TIME-EA4和TIME-likes,说明TIME-EA4比Cu／Zn SOD出现得晚,因此推测家蚕TIME-EA4起源于Cu／Zn SOD。
⑵家蚕TIME-EA4是一种新型酯酶。家蚕TIME-EA4最初是通过酯酶分离纯化方法获得的一种酯酶,能够被酯酶特异性染料着色,其N-末端有ATPase结构域,是发挥时间间隔测定功能的位点。TIME-EA4与Cu／Zn SOD的Cu／Zn离子绑定位点在氨基酸残基组成、极性和接触原子等方面存在着差异。TIME-EA4除具有Cu／Zn SOD功能位点外,还具有酯酶的功能位点。家蚕TIME-EA4和野桑蚕(Bombyx mandarina)的TIME-like(Bm-TIME-like)与酯酶进化距离较近,其他4个昆虫物种的TIME-likes与酯酶和非脊椎动物的Cu／Zn SOD聚为一大类。推测TIME-EA4(TIME-likes)是起源于Cu／Zn SOD的新型酯酶,在不同的昆虫物种中,TIME-EA4(TIME-likes)以不同速率向酯酶进化,家蚕由于数千年的人工驯化加速了这一进化过程。
⑶家蚕具有两类昼夜节律核心钟基因Bmcry1与Bmcry2。通过电子克隆、RT-PCR和RACE技术获得了家蚕Bmcry1与Bmcry2全长cDNA序列,长度分别为2166 bp和2389 bp(HM747059和HM747060),拼接了全基因序列(HM747057和HM747058)。Bmcry1基因具有12个外显子和11个内含子,Bmcry2具有9个外显子,8个内含子。染色体定位表明Bmcry1和Bmcry2分别位于17号和15号染色体。同源建模获得了BmCRY1和BmCRY2蛋白的三维结构,其FAD入口大而深,与CRY不结合嘧啶二聚体相符:BmCRY1和BmCRY2表面多为负电荷,只在FAD入口位置有正电荷富集。多序列比对、蛋白质基序、功能域、聚类分析等结果显示,BmCRY1和BmCRY2分属昆虫CRY1和CRY2,与柞蚕(Antheraea pernyi)等鳞翅目昆虫CRY蛋白亲缘关系最近。家蚕的2类CRY与其他昆虫CRY相似,都具有DNA光解酶和FAD结合功能域,但保守位点和基序位点不同。本实验为进一步研究家蚕CRY1和CRY2的分子进化机制和功能创造了条件。
⑷家蚕昼夜节律生物钟基因的挖掘与反馈环路的初步整合。克隆了家蚕Bmvri,Bmcyc,Bmtim2,Bmpdp完整的ORF序列及Bmclk基因的ORF片段。基因结构分析和染色体定位表明:Bmvri基因具有2个外显子,1个内含子,位于家蚕的第27号染色体的nscaf3072上；Bmpdp基因具有7个外显子,6个内含子,位于家蚕第1号染色体的nscaf2734上；Bmtim2基因具有21个外显子,20个内含子,位于家蚕的第9号染色体的nscaf3048上；Bmcyc基因具有10外显子,9个内含子,位于家蚕第1号染色体的nscaf2734上。Bmpdp与Bmcyc位于同一条染色体的同一个nscaf上,只是具体位置有差异。系统进化分析显示,家蚕VRI、PDP、PER、TIM1、TIM2和CYC分属昆虫相应蛋白组群,同纲目昆虫同源蛋白进化距离较近,符合它们的亲缘关系。无论是进化距离还是功能域,昆虫TIM2都与脊椎动物TIM1相近,可见脊椎动物TIM1在昆虫中的真正同源蛋白是TIM2,不是TIM1。
⑸功能域和MOTIFS分析表明,BmVRI和BmPDP蛋白的DNA结合功能域氨基酸序列很相似,推测它们可以结合相同的DNA序列,即Clk基因的启动子。BmPER和BmTIM(TIM1和TIM2)都不具备DNA结合位点,但它们都具有蛋白质互作基序位点,可知PER和TIM可通过蛋白质互作实现信号传感。BmCYC除具有蛋白质互作基序位点(bHLH、PAS、PAC)外,还具备转录激活功能域,且高度保守。家蚕基本具有果蝇(Drosophila)所有昼夜节律生物钟基因的同源基因,根据这些基因表达产物的结构特征结合现有数据资源,初步整合了家蚕昼夜节律生物钟反馈环路,它结合了果蝇和大红斑蝶(Danaus plexippus)反馈环路的特点,它们的核心生物钟基因转录.翻译反馈环路是很保守的。