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目的:代谢物一般是生物体在代谢过程中产生的有机小分子物质,对其有效的检测有助于反映机体的病理生理状态。但现有的检测代谢物小分子的方法多需要依靠昂贵的仪器设备,专业的操作人员,另一些方法由于其检测特异性等指标的限制,尚不能进行实验室到床旁检测的有效转化,因此开发灵敏、特异、快捷、低成本的检测代谢物的新方法十分重要。据报道,大肠杆菌三分之一的转录因子(Transcription factors,TF)均可以通过响应代谢物调控基因表达。这些天然识别蛋白在结合代谢物方面表现出较高的选择性与亲和力,因此是构建代谢物检测生物传感器的理想识别元件。本研究旨在基于两种不同作用方式的阻遏型TF,设计并开发新型的代谢物检测生物传感器,为即时检测(Point-of-care testing,POCT)提供新的技术方案。我们分别选取两种原核生物转录因子半乳糖阻遏蛋白(Galactose repressor,GalR)和色氨酸阻遏蛋白(Tryptophan repressor,TrpR),用以验证构建的新技术方案。方法:1、GalR与操纵序列结合,抑制转录,D-Gal能够结合GalR,并解除转录抑制作用。我们将该类型repressor的“开关作用”与重组酶聚合酶技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)技术相结合,开发检测半乳糖(D-galactose,D-Gal)的新型生物传感器,命名为repressor-RPA。(1)在体外表达纯化重组GalR蛋白(2)构建包含GalR识别序列的重组载体(3)建立repressor-RPA技术并进行条件优化(4)进行repressor-RPA技术检测D-Gal的方法学表征2、L-Trp可以结合并变构TrpR蛋白,使其结合识别序列,抑制转录。我们将该类型repressor与分子信标(Molecular beacon,MB)相结合,创造性提出TF-splinting策略,并基于此开发出检测L-Trp的新型生物传感器TFSD(Transcription factors splinting duplex)。(1)在体外表达纯化重组TrpR蛋白(2)构建检测L-Trp的生物传感器TFSD(3)TFSD技术的条件优化(4)进行TFSD技术检测L-Trp的方法学表征结果:通过对D-Gal的检测,证明了基于repressor的作用方式构建的repressor-RPA生物传感器检测代谢物的可行性。实验首先在体外成功表达了GalR重组蛋白,并构建包含GalR识别序列的RPA扩增模板,然后通过琼脂糖凝胶电泳验证方法可行性,并对体系的模板浓度,GalR浓度进行优化。在最优条件下,对该技术进行方法学表征,得到其对D-Gal的最低检测限为3.36μM,并验证其能够特异性地有效区分其他类型单糖。通过对L-Trp的检测,证明了基于repressor调控分子信标的TF-splinting策略构建生物传感器检测代谢物的可行性。实验首先在体外成功表达了TrpR重组蛋白,然后通过MB荧光波谱图验证新技术的可行性,并对检测体系进行了系列条件优化。在最优条件下,对该技术进行方法学表征,得到其对L-Trp的最低检测限为0.79μM,并验证其能够特异性地有效区分其他氨基酸与色氨酸类似物。结论:我们成功地利用两种不同类型的阻遏型TF分别构建了两种新型的生物传感器。这两种检测新技术均能够方便、快速地检出生物样本中的相应代谢小分子。