论文部分内容阅读
[目的]
一些天然小分子化合物如(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、半边旗二萜类化合物(5F)，它们本身具有良好的抗癌效应，但却存在代谢快，易氧化等缺点，使其抗癌效应受到了大大的限制。目前，用纳米材料作为药物输送载体已经成为一项热门的研究，它有缓释药物、靶向输送、延长药物作用时间、减轻毒副反应等优点。本论文通过MTT、平板克隆、流式细胞仪测凋亡、western blot、裸鼠体内成瘤等实验方法，研究了一种核内包覆FITC的功能化核-壳胶体介孔二氧化硅纳米粒子体系(CMS)负载(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)和半边旗二萜类化合物5F后，观察其是否有增强抗肿瘤药物效应和在活体内靶向输送的作用及其作用机制。
[方法]
本论文分为两部分:实验一:观察纳米材料CMS负载药物后能否增强小分子化合物的抗癌作用;实验二:观察纳米材料CMS表面修饰透膜小肽(CPPs)和引导性肽(PEGA肽)后能否实现EGCG对人乳腺癌细胞MCF-7的靶向运输作用。
实验一:功能化核-壳胶体介孔二氧化硅纳米粒子体系(CMS)对EGCG、5F抗癌效应的影响:
1.电子显微镜观察CMS的形态大小和粒径;
2.用透析膜检测CMS负载EGCG后EGCG在PBS溶液中不同时间段的药物释放率;
3.激光共聚焦显微镜观察CMS核内包覆的FITC，确定CMS是否能透过人鼻咽癌细胞CNE-2Z的细胞膜并进入细胞中发挥作用。
4.MTT法检测CMS、EGCG、CMS负载后的EGCG(CMS-EGCG)三者对人鼻咽癌细胞CNE-2Z的生长抑制作用;
5.流式细胞仪检测CMS、EGCG、CMS-EGCG对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z周期的影响。
6.western blot检测EGCG、CMS-EGCG作用于人鼻咽癌细胞CNE-2Z后Pin1蛋白水平的表达;
7.平板克隆法检测5F对人鼻咽癌细胞CNE-2Z的生长抑制作用;
8.CCK-8法检测5F、CMS、CMS负载后的5F(CMS-5F)三者对人鼻咽癌细胞CNE-2Z的生长抑制作用;
9.western blot检测CMS、5F以及CMS负载后的5F（CMS-5F）作用于人鼻咽癌CNE-2Z细胞后(p-ERK1/2，ERK1/2，p-MSK1，MSK1)蛋白水平的表达情况;
10.caspase-3蛋白检测试剂盒检测加入药物CMS、5F和CMS-5F后对细胞中caspase-3酶活性的影响和改变。
实验二:纳米材料CMS表面修饰透膜小肽(CPPs)和引导性肽(PEGA)后负载的EGCG(小肽-CMS-EGCG)对人乳腺癌细胞MCF-7在活体内的靶向运输作用:
1.MTT法检测EGCG、CMS-EGCG和小肽-CMS-EGCG三者对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用;
2.Caspase-3凋亡蛋白试剂盒检测EGCG、CMS-EGCG和小肽-CMS-EGCG处理人乳腺癌细胞MCF-7后的对细胞凋亡的影响情况;
3.western blot检测EGCG、CMS-EGCG和小肽-CMS-EGCG作用于人乳腺癌细胞MCF-7后周期调控蛋白(p-erk1/2，ERK1/2，P-MSK1，MSK1)蛋白水平的表达情况;
4.流式细胞仪检测EGCG、CMS-EGCG和小肽-CMS-EGCG对人乳腺癌细胞MCF-7的凋亡情况的影响;
5.建立MCF-7细胞裸鼠移植瘤模型:研究CMS、EGCG、CMS-EGCG和小肽-CMS-EGCG对人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用;
6.取裸鼠肝、肺、肾组织，制备切片后，H&E染色观察药物对组织的损伤情况。
[结果]
实验一功能化核-壳胶体介孔二氧化硅纳米粒子体系(CMS)对EGCG、
5F抗癌效应的影响
1-电子显微镜结果显示CMS是表面多孔性结构，平均粒径大小为50nm以内;
2.取不同时间段测定CMS-EGCG的药物释放率，最大释放率为40％，在25 h时达到最高，药物释放基本已达到平衡;
3.共聚焦结果显示CMS能够进入细胞膜围绕在核周围，并且随着浓度增大进入细胞膜的CMS的量也增多。
4.MTT法检测显示CMS对人鼻咽癌细胞CNE-2Z的生长无抑制作用，EGCG、CMS-EGCG对人鼻咽癌细胞CNE-2Z有明显的生长抑制作用，且抑制作用为EGCG＜CMS-EGCG;
5.流式细胞仪结果显示CMS对人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2Z的周期无影响，EGCG、CMS-EGCG使人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2Z的周期抑制在S期，且抑制强度为EGCG＜CMS-EGCG。
6.western blot结果显示EGCG、CMS-EGCG作用于人鼻咽癌细胞CNE-2Z后PIN1蛋白水平有明显的降低且浓度越大降低得越多，降低程度是EGCG＜CMS-EGCG。
7.平板克隆法结果显示5F对人鼻咽癌细胞CNE-2Z有生长抑制作用，且随着5F浓度增大，抑制作用增强;
8.CCK-8法结果显示CMS对人鼻咽癌细胞CNE-2Z无生长抑制作用，5F、CMS-5F对人鼻咽癌细胞CNE-2Z均有明显的生长抑制作用，且抑制作用5F＜CMS-5F。
9.caspase-3蛋白检测试剂盒结果显示:5F、CMS-5F分别处理人鼻咽癌细胞CNE-2后细胞的caspase-3蛋白活化，活化程度为5F＜CMS-5F，而CMS对细胞的caspase-3蛋白无影响。
10.western blot结果显示5F、CMS-5F作用于人鼻咽癌细胞CNE-2Z后p-ERK1/2、P-MSK1蛋白表达水平有明显的降低，且降低程度为5F＜CMS-5F， CMS对CNE-2Z细胞的p-ERK1/2、P-MSK1蛋白水平表达无影响。
实验二EGCG、CMS-EGCG、CMS表面修饰透膜小肽(CPPs)和引导性肽(PEGA肽)后负载的EGCG(小肽-CMS-EGCG)对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用
1.MTT法检测EGCG、CMS-EGCG和小肽-CMS-EGCG三者对人乳腺癌细胞MCF-7的生长均有明显抑制作用，且抑制强度为EGCG＜CMS-EGCG＜小肽-CMS-EGCG，CMS对人乳腺癌细胞MCF-7的生长无抑制作用;
2.caspase-3蛋白检测试剂盒结果显示:EGCG、CMS-EGCG、肽-CMS-EGCG分别处理人乳腺癌细胞MCF-7后，细胞的caspase-3蛋白含量增加，为EGCG＜CMS-EGCG＜肽-CMS-EGCG，CMS对细胞中caspase-3蛋白含量无影响。
3.western blot检测CMS、EGCG、CMS-EGCG和小肽-CMS-EGCG作用于人乳腺癌细胞MCF-7后，p-ERK1/2、P-MSK1蛋白表达水平有明显的降低，且降低程度为5F＜CMS-5F，CMS对CNE-2Z细胞的p-ERK1/2、P-MSK1蛋白水平表达无影响;
4.流式细胞仪和荧光显微镜检测结果显示:EGCG、CMS-EGCG和小肽-CMS-EGCG对人乳腺癌细胞MCF-7的凋亡均有促进作用，且EGCG＜CMS-EGCG＜肽-CMS-EGCG，CMS对细胞凋亡无影响。
5.裸鼠体内成瘤试验表明，EGCG、CMS-EGCG和小肽-CMS-EGCG对人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤的生长均具有一定程度的抑制作用，且抑制程度为EGCG＜CMS-EGCG＜肽-CMS-EGCG，CMS对肿瘤生长无影响，说明肽-CMS-EGCG对乳腺癌细胞是具有靶向性的。
6.H&E染色结果:显示EGCG、CMS-EGCG和小肽-CMS-EGCG对裸鼠的肝、肾组织均无损伤，对肺组织有轻微的损伤。
[结论]
小分子化合物EGCG、5F对细胞人鼻咽癌CNE-2Z的生长增殖有明显的抑制作用，并且可以认为此作用是与MAPK家族中ERK1/2，MSK1通路有关的。纳米材料CMS做载体修饰后明显的增强了EGCG和5F对肿瘤细胞的生长抑制作用，P-ERK1/2，P-MSK1表达水平也相应降低，且纳米材料CMS本身对癌细胞是没有生长抑制作用的;裸鼠实验表明，纳米材料表面修饰PEGA肽和CPPs后负载的EGCG对裸鼠乳腺癌移植瘤的生长比EGCG和CMS-EGCG有更为明显的抑制作用，且没有严重的组织损伤。但是EGCG、CMS-EGCG、肽-CMS-EGCG在裸鼠体内是通过什么凋亡途径来实现抑制肿瘤细胞生长的目的还有待进一步的研究。