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Duchenne型肌营养不良症(DMD)是一种以骨骼肌进行性变性、坏死为主要病理特征的X-性连锁隐性遗传性肌肉疾病，在出生活男婴中发病率为1/3500。目前已知DMD是由编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变导致该蛋白缺失而引起发病的。患儿一般3～5岁开始出现临床症状，12岁后丧失行走能力，常于20岁左右死于呼吸/循环衰竭。mdx鼠是最常应用的DMD动物模型，广泛用于对该病病理机制和治疗方面的研究。
本研究拟在体外通过激活经典Wnt信号通路，探讨该通路对于体外培养的大鼠骨髓MSCs向肌细胞特异性分化、增殖、和迁移的影响，以明确有关MSCs增殖、迁移和定向分化的分子机制，然后将经Wnt分子预处理的MSCs移植治疗mdx鼠，探讨Wnt信号对于移植细胞在体内分化为有功能肌细胞的影响，为明确有关MSCs向成肌分化的机制，指导应用MSCs治疗肌肉疾提供理论基础。
1 材料和方法：
1.1.实验材料
1.1.1.实验动物SD大鼠(60-80g)20只作为供体鼠。6-8周龄mdx鼠共36只，随机分为三组，每组12只：(1)mdx对照鼠(12只)：给予0.3ml无血清DMEM培养基尾静脉注射；(2)对照rMSCs移植鼠(12只)：给予经50％L条件培养基(L-CM)预处理3天的大鼠MSCs尾静脉移植治疗；(3)Wnt3a预处理MSCs移植鼠(12只)：给予经50％Wnt3a条件培养基(Wnt3a-LM)预处理3天的大鼠MSCs尾静脉移植治疗。移植后4w、8w、12w、16w为观察点，每一时间点3只鼠。
1.1.2.实验试剂与器材(略)。
1.2实验方法：
1.2.1.rMSCs分离、培养、鉴定采用差速贴壁法分离、扩增及纯化SD大鼠MSCs，并进行表面抗原检测和成骨、成脂分化能力鉴定，将形态一致的P<,5～7>代MSCs进行后续实验。
1.2.2.真核表达质粒pGKWnt3a，pGKneo和hβ-catenin(S37A)的扩增、纯化及鉴定分别将质粒pGKWnt3a，pGKneo和hβ-catenin(S37A)转化感受态细菌进行扩增，提取质粒DNA,进行酶切鉴定。
1.2.3.pGKWnt3a转染L细胞鉴定及条件培养基制备采用脂质体2000介导质粒pGKWnt3a转染L细胞，G418筛选阳性细胞克隆。应用免疫荧光、RT-PCR和Western blot鉴定pGKWnt3a在L细胞中的表达。制备含Wnt3a的条件培养基(Wnt3a-CM)，并用Western blot进行Wnt3a蛋白鉴定。同时制备对照L条件培养基(L-CM)和用经特异性Wnt3a抗体孵育处理去除Wnt3a蛋白的条件培养基(Wnt3a depl-CM)。
1.2.4.Wnt3a对rMSCs增殖、分化、迁移的影响。
1.2.4.1.Wnt3a对rMSCs细胞β-catenin亚细胞分布的影响应用β-catenin抗体进行免疫荧光检测不同浓度的Wnt3a-CM、L-CM和Wnt3a depl-CM孵育24小时后rMSCs细胞的β-catenin亚细胞分布，并统计β-catenin阳性细胞率。
1.2.4.2.Wnt3a对rMSCs增殖的影响分别应用细胞计数和Brdu掺入实验，检测不同浓度Wnt3a-CM、L-CM和Wnt3a depl-CM对rMSCs增殖的作用。
1.2.4.3.Wnt3a对rMSCs向成肌分化的影响将P<,5>代rMSCs分别在含有不同浓度Wnt3a-CM、L-CM和Wnt3adepl-CM的成肌诱导培养基培养。在规定时间点分别应用免疫荧光检测desmin和devMHC的表达，应用RT-PCR检测成肌调节相关基因Pax3、Pax7、MyoD、Myf5、myogenin、Myf4、devMHC的表达。
1.2.4.4.Wnt3a对rMSCs向成脂分化的影响将P<,5>代rMSCs分别在含有不同浓度Wnt3a-CM和L-CM的成脂诱导培养基培养。在规定时间点用油红O染色法检测脂滴形成，并测定油红O吸光度；RT-PCR检测成脂调节基因PPAR-γ和C/EBP-α的表达。
1.2.4.5.Wnt3a对rMSCs迁移能力的影响分别应用细胞划痕和Transwell小室细胞迁移实验，检测不同浓度Wnt3a-CM、L-CM和Wnt3a depl-CM培养对rMSCs迁移能力的影响。
1.2.5.hβ-catenin(S37A)对rMSCs向成肌、成脂分化的影响。
1.2.5.1.hβ-catenin(S37A)质粒转染rMSCs及表达鉴定采用脂质体2000介导hβ-catenin(S37A)质粒转染rMSCs，G418筛选阳性细胞。应用免疫荧光、RT-PCR和Western blot鉴定hβ-catenin(S37A)质粒在rMSCs中的表达。将转染hβ-catenin(S37A)质粒的rMSCs命名为rMSC(S37A)，转染对照空质粒细胞命名为rMSC(E)。
1.2.5.2.hβ-catenin(S37A)对rMSCs向成肌分化的影响将rMSC(S37A)和对照组细胞在成肌诱导培养基中培养，在规定时间点分别进行免疫荧光检测MyoD，myogenin,desmin和devMHC的表达，RT-PCR检测Pax3、Pax7、MyoD、Myf5、myogenin、Myf4和devMHC的表达。
1.2.5.3.hβ-catenin(S37A)对rMSCs向成脂分化的影响将rMSC(S37A)和对照组细胞在成脂诱导培养基中培养。在规定时间点应用油红O染色法检测脂滴形成，并测定油红O吸光度；RT-PCR检测PPAR-γ和C/EBP-α的表达。
1.2.6.rMSCs移植前BrdU的标记于移植前48h将终浓度为10 mol/L的BrdU掺入待移植细胞中，并检测BrdU标记率。
1.2.7移植后运动功能测试在移植后各时间点测试Wnt3a预处理rMSCs、对照rMSCs移植组和未移植组mdx鼠牵引实验。让鼠4爪抓住钢丝，计数3min内从钢丝上坠落次数。
1.2.8.移植后肌酸激酶(CK)的测定在移植后不同时间点分别取Wnt3a预处理rMSCs、对照rMSCs移植组和未移植组mdx鼠1.2ml外周血，取血清约250ul,CK-NAC检测CK值。
1.2.9.移植后骨骼肌组织HE染色不同时间点分别取Wnt3a预处理rMSCs、对照rMSCs移植组和未移植组鼠腓肠肌和膈肌，冰冻切片后进行HE染色，镜下观察细胞形态， 200倍取10个视野，计数肌细胞核中心移位纤维比例。
1.2.10.移植后骨骼肌dystrophin的免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测不同时间点分别取Wnt3a预处理rMSCs、对照rMSCs移植组和未移植组鼠腓肠肌和膈肌，做免疫荧光染色、RT-PCR和Western Blot，检测dystrophin的表达情况。
1.2.11.移植后腓肠肌MyoD的免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测不同时间点分别取Wnt3a预处理rMSCs、对照rMSCs移植组和未移植组鼠腓肠肌进行免疫荧光染色、RT-PCR和Western Blot，检测MyoD的表达情况。
1.2.12.移植后腓肠肌devMHC的免疫荧光、RT-PCR检测不同时间点分别取Wnt3a预处理rMSCs、对照rMSCs移植组和未移植组鼠腓肠肌进行免疫荧光染色和RT-PCR，检测devMHC的表达情况。
1.2.13. Wnt3a预处理干细胞移植后在mdx鼠体内生物安全性观察不同时间点解剖干细胞移植治疗鼠，观察各器官形态结构有无异常，有无肿瘤或者畸形的发生。
1.2.14.统计分析所有统计学数据采用SPSS12.0进行t检验和单因素方差分析，显著性检验水准为α=0.05。
2.结论：
1.应用Wnt3a条件培养基和转染活化hβ-catenin(S37A)质粒来激活大鼠骨髓间充质干细胞的经典Wnt通路，能够激活成肌相关基因的表达，诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成肌方向分化。(创新点1)
2.通过激活Wnt信号通路，能够抑制成脂相关基因的表达，抑制大鼠骨髓间充质干细胞向成脂方向分化。(创新点2)
3.激活Wnt信号通路能够增强大鼠骨髓间充质干细胞增殖和迁移能力。(创新点3)
4.经Wnt分子预处理的大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠，能够增加移植的间充质干细胞向成肌分化的效率，并表达更多的dystrophin蛋白，更好的纠正DMD模型鼠的病理表型。(创新点4)