论文部分内容阅读
为了研究禽流感灭活疫苗免疫的分子机制,发现新的抵抗禽流感病毒基因,为抗禽流感病毒转基因鸡的制作提供候选基因,同时也为抗禽流感病毒药物的研制奠定基础,本研究应用mRNA差异显示技术,以40只30日龄AA白羽肉鸡(ARBOR ACRES)为材料,其中20只鸡注射H5亚型禽流感灭活疫苗,另20只未注射疫苗鸡作为对照,对照组(A组)和注射组(B组)在注射9天时宰杀,取脾脏放液氮中保存。采用TRIZOL法提取脾脏总RNA,经DNA酶Ⅰ消化除去基因组DNA,用分光光度计将每个个体总RNA稀释到一定浓度,将每个组的20个RNA样品取等量组建RNA池,然后分别用3条锚定引物反转录为cDNA。采用3条锚定引物和18条随机引物组成的54对引物对以cDNA为模板分别扩增两组样品。两组扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,银染后,切割两组样品的差异表达条带。以回收的差异条带为模板,进行二次扩增,并回收纯化。回收产物采用以地高辛标记的反Northern点杂交鉴定,阳性条带连接T载体,转化大肠杆菌,挑白色单克隆摇菌,提取质粒,经酶切鉴定后测序。差异不明显片段用半定量RT-PCR鉴定。筛选出13条抗禽流感病毒免疫相关基因的ESTs,分别编号为DD1-DD13,其中DD1、DD2仅在A组中表达,DD3、DD4在A组中表达量高于B组;DD5、DD6、DD7、DD8、DD9仅在B组中表达,DD10、DD11、DD12、DD13在B组中表达量高于A组。应用BLASTn工具将13条ESTs对核酸数据库nr和dbEST中所有序列进行了同源性分析。DD10、DD13为同一条序列,都与鸡核糖体蛋白L7a基因有高度的相似性,为这个基因的EST。人核糖体蛋白L7a在肿瘤和疾病过程中发挥重要作用,推测鸡核糖体蛋白L7a可能参与禽流感疫苗免疫过程,可能具有抵抗禽流感病毒的作用。DD7与预测的鸡类T细胞受体α亚基基因有一定的同源性,T细胞具有抵抗和清除禽流感病毒的作用。DD3、DD4、DD6、DD9、DD11、DD12与已有核酸数据库中的基因克隆或EST具有较高相似性,为已知的ESTs,但功能未知。DD1、DD2、DD5、DD8没有发现同源序列,为新的ESTs。将这4条新ESTs提交GenBank,分别获得登陆号为EB714185、EB714186、EB714187、EB714188。应用数据库资源将DD3延伸至1483bp,DD11延伸至1076bp,DD12延伸至826bp。对DD3、DD11、DD12进行电子表达谱分析,发现DD3在脑、雌性生殖器、心脏、软组织中表达,DD11在脑、腔上囊、软骨、胃肠道、心脏、肝脏、肌肉、胰腺、软组织、脾脏中表达,DD12在脑、雌性生殖器中表达。通过与鸡基因组数据库进行同源性检索,除了DD4、DD5外都找到了对应的基因组序列,进行了定位。对DD1、DD2、DD5、DD8用BLASTx工具对非冗余蛋白质数据库nr进行了相似性搜索。本研究筛选出的鸡核糖体蛋白L7a基因、鸡类T细胞受体α亚基基因和其它ESTs