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研究背景瘦素(Leptin)是体内一种重要的作用于多靶器官,功能广泛的蛋白质类激素,其主要生理功能包括:①抑制摄食、增加能量消耗;②调节生长发育;③调节炎症反应、免疫功能;④促上皮细胞、血管生长;⑤调节神经内分泌;⑥保护消化系统功能;⑦维持正常的血脂代谢等。并且能够参与生殖、血压、造血、胎儿的生长发育以及内分泌调节等功能。近些年来人们研究发现,瘦素与许多种恶性肿瘤的发病、发生存在着密切的关系。瘦素的主要来源是白色脂肪组织,通过瘦素受体的介导,发挥各种生物学作用,它的主要生理作用包括:抑制食欲、减少能量摄取、增加能量消耗、抑制脂肪合成、调节机体脂肪的沉积等等。高脂肪饮食,能够致使瘦素分泌增高。测定血清中瘦素水平,能够反映出机体脂肪细胞数量和脂肪组织体积。瘦素(Leptin)也称ob蛋白,是肥胖基因(位于人染色体7q32)编码的一种由167个氨基酸组成分泌型蛋白质,分泌入血后形成含146个氨基酸残基的活性瘦素,分子量为16ku。其主要功能是调节能量平衡,是维持正常体重的基本激素。自Zhang等首先发现瘦素基因以来,人们已对瘦素的生物学作用进行了大量研究。近年来,有关瘦素及其受体在对肿瘤的发生、发展过程中的作用也逐步开展了相应的研究。尤其是瘦素能够刺激多种肿瘤细胞增殖的作用,其机制可能与增加肿瘤细胞对基膜的侵袭能力以及促进肿瘤内新生血管形成等因素有关,故瘦素被认为是一种新的促肿瘤生长因子。有实验表明,瘦素及瘦素受体在乳腺癌、肺腺癌以及消化道肿瘤组织和肿瘤细胞株中均有表达。前列腺癌是老年病,极少在50岁以前发病,90%的前列腺癌死亡年龄在65岁以后,中位年龄是77岁。其发病率和死亡率在世界范围有极大的差异,美国前列腺癌发病率居男性肿瘤首位,死亡率仅次于肺癌;最低的是中国上海,发病率为2/10万,两者相差60倍。我国前列腺癌发病率较低,仅为2.41/10万男性人口。但近年随着人口老龄化及肥胖人群的增多,发病率有明显增加的趋势。我国前列腺癌在男性泌尿、生殖系统恶性肿瘤中发病率跃居第三位,前列腺癌正在悄悄地影响着我国50岁以上男性的生活质量和预期寿命。有流行病学研究人员调查发现,前列腺癌的发病受多种因素影响,如:体内雄激素含量增多、肥胖、年龄增加、吸烟或大量饮酒以及家族遗传史等环境因素和遗传因素。截止目前,人们对前列腺癌具体的发病机制仍不清楚,但是可以判断,前列腺癌的发生、发展与肥胖有着密切的关系。临床上,雄激素阻断是前列腺癌治疗的最有效方法。但不幸的是,约80%的前列腺癌在去雄激素治疗后的12—18个月左右发生雄激素非依赖性生长,雄激素阻断失去治疗作用,肿瘤继续生长并恶化,病人死于该病。雄激素非依赖性前列腺癌(androgen independent prostate caneer,AIPC)的发生成为前列腺癌治疗中最棘手的问题。AIPC发生的机制是目前研究的热点。上述情况表明,针对如何延缓雄激素依赖型前列腺癌(androgen dependent prostate cance,ADPC)向雄激素非依赖型前列腺癌的转变,以及探寻雄激素非依赖型前列腺癌的治疗方法,已经成为目前研究前列腺癌方面的焦点课题。目前对于前列腺癌细胞的基础研究中,有三种细胞株现已广泛的应用于人前列腺癌的研究领域,这三种细胞株是LNCaP、DU- 145和PC-3,其中LNCaP是雄激素依赖性前列腺癌细胞株,DU- 145和PC-3是雄激素非依赖性前列腺癌细胞株。经研究发现,JAK2-STAT3途径介导瘦素信号传递是瘦素作用的主要通路。瘦素受体通过偶联和激活胞质酪氨酸激酶JAK(主要是JAK-1和JAK-2)而实现信号转导。有学者用瘦素,在体外刺激雄激素非依赖性前列腺癌细胞株后,观察到血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子-β1 ( transforming growth factor-β1, TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast growth factor, bFGF)过量表达,而前列腺癌细胞的迁移活性也相应增加,结果表明瘦素在促进雄激素非依赖性前列腺癌细胞增殖及诱导细胞迁移的方面,发挥了一定的作用。有研究表明,对于瘦素通过JAK2-STAT3信号转导通道在前列腺癌的发生、发展中的相关研究目前国内外研究较少,因此本实验采用MTT等方法来检测不同浓度瘦素刺激下各组前列腺癌DU-145细胞株增殖作用的变化,从而比较不同浓度瘦素刺激下各组前列腺癌细胞的分泌功能。同时根据JAK酶抑制剂AG490可阻断JAK2-STAT3信号转导通道的机制,初步讨论其抑制瘦素对前列腺癌DU-145细胞株的增殖作用。目的本实验旨在探讨不同浓度瘦素以及经JAK酶抑制剂作用后对激素非依赖型前列腺癌细胞的刺激,观察前列腺癌细胞在瘦素干预下生长情况及相关基因的表达情况,为临床进一步明确前列腺癌发病机制提供帮助。方法1.采用体外细胞培养法,选用中国医学科学院肿瘤细胞库提供的激素非依赖型前列腺癌DU-145细胞作为实验用种子细胞。2.对培养的前列腺癌细胞进行观察和鉴定。3.取生长良好的前列腺癌细胞,传代培养,随机分组,共分为15组,分别加入含0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、100ng/ml、1000 ng/ml瘦素的1640培养基。培养12h、24h和48h。4.用MTT法分别测定上述15组不同浓度的瘦素作用于体外培养前列腺癌DU-145细胞的细胞活性。5.再次取生长良好的前列腺癌细胞,随机分组,共分为4组,分别加入含100ng/mL瘦素、100 ng/mL瘦素+20μmol/L AG490、100 ng/mL瘦素+50μmol/L AG490、100 ng/mL瘦素+100μmol/L AG490的1640培养液。培养24h。6.以MTT法测定上述4组不同浓度的含AG490的瘦素刺激DU-145细胞增殖的抑制作用。7.用流式细胞仪分别检测上述各组不同浓度瘦素干预下的前列腺癌DU-145细胞的增殖情况。8.用SPSS13.0软件对结果进行统计学分析。结果1、通过对细胞形态学观察证实中国医学科学院肿瘤细胞库提供的细胞确实为前列腺癌DU-145细胞。2、MTT法测定显示:在瘦素干预下的各组细胞的活性明显优于空白组,在0-100ng/mL瘦素质量浓度范围内,瘦素质量浓度越高,细胞增殖越明显;当瘦素质量浓度达100ng/mL时,其促增值效应最显著,在100-1000ng/mL范围内,瘦素质量浓度增高,对细胞增殖趋于缓和,细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)。3、MTT法检测发现,不同浓度的AG490作用前列腺癌细胞24h后,随着AG490浓度增高,其抑制瘦素促进DU-145细胞增殖的作用逐渐增强;各不同浓度组之间比较,差异有统计学意义((P<0.05)。4、流式细胞仪测定结果显示:在瘦素干预下的各组细胞的增殖情况明显优于空白组,并且随着瘦素浓度增加细胞的数量也逐渐增加,在瘦素浓度加到1000 ng/ml时,被测细胞的PI值达到最高。与其他实验组对比也具有显著地差异性(P<0.05)。结论瘦素可以促进激素非依赖型前列腺癌DU-145细胞增殖、活性及相关基因的表达,并且随着瘦素浓度增加无论是前列腺癌细胞增殖、活性呈是上升趋势;此外,加入AG490后可明显抑制其对前列腺癌细胞增殖效果,说明瘦素对促进前列腺癌的发生、发展起着重要作用,这种作用可能是通过JAK2-STAT3信号转导通道实现的。