论文部分内容阅读
研究背景:骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种由关节软骨和基础骨破坏引起的一种退行性关节炎疾病,早期主要表现为关节疼痛、行动受阻,在后期常常因关节软骨的严重磨损而无法正常活动,为病患家属和社会造成了极大的负担。目前OA在临床上主要采用药物与手术治疗的方式,药物治疗主要包括使用改善症状药物、改善病情药物及软骨保护剂等,而手术治疗则多采用关节镜手术、截骨术、关节置换术及关节融合术。然而,由于OA发病的分子机制目前尚不完全明晰,其治疗仍停留在止痛及有限的改善肢体功能上。目前研究认为关节软骨退变在一定程度上决定着OA的发展进程,因此,深入探索抑制关节软骨退变损伤的有效方法及分子机制,从而有效限制及缓解OA进展,将对OA的预防与诊治具有十分重要的研究意义。关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)两部分构成,软骨细胞是关节软骨中存在的主要细胞,对关节软骨发挥正常生理功能具有重要的作用。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一种普遍存在于真核生物体内的小RNA分子,参与调控多项生命活动。近来已有多项研究显示,lncRNA在OA组织和细胞中存在异常表达,且lncRNA可通过内源竞争RNA(competing endogenous RNA,ce RNA)机制与miRNA形成靶向调控轴在OA中的软骨细胞增殖,凋亡及炎症反应中发挥调控作用。鉴于OA的具体发病机制还不清楚,研究lncRNA与OA发生之间的关系具有重要意义。研究目的:本研究旨在探讨lncRNA MEG3在正常和OA软骨细胞中的表达水平差异,进而研究lncRNA MEG3调控IL-1β诱导的软骨细胞损伤过程中具体的分子机制,为OA的预防和治疗提供新的理论依据。研究方法:1.分离SD大鼠关节软骨细胞并使用IL-1β处理,建立OA细胞模型,运用MTT、流式细胞术、q PCR、Western blot等技术分别检测细胞活力,凋亡,MMP-13、ADAMTS-5、COL2A1的m RNA和蛋白表达水平,以及MEG3、miR-93的表达水平,验证OA体外模型的成功建立,以及lncRNA MEG3和miR-93在OA中的差异表达;2.细胞转染MEG3过表达/敲低载体,运用Ed U、流式细胞术、q PCR、Western blot等实验技术分别检测细胞增殖,细胞凋亡,MMP-13、ADAMTS-5、COL2A1 m RNA和蛋白的表达水平,探究lncRNA MEG3在OA进程中对软骨细胞增殖、凋亡和ECM降解的影响;3.细胞分别转染MEG3过表达/敲低及miR-93过表达/抑制载体,运用q PCR、Western blot等技术分别检测MEG3、miR-93、TGFBR2表达水平,验证lncRNA MEG3通过ce RNA机制与miR-93相互作用间接调控TGFBR2的表达;4.细胞转染MEG3和miR-93过表达载体,运用Ed U、流式细胞术、q PCR、Western blot、免疫荧光等技术分别检测增殖,凋亡,TGFBR2、MMP-13、ADAMTS-5、COL2A1的表达水平,MMP-13、COL2A1表达定位,进一步证明lncRNA MEG3通过miR-93/TGFBR2信号轴调控OA进程中软骨细胞增殖、凋亡和ECM降解。研究结果:1.IL-1β处理软骨细胞后,降低了细胞活力、促进了细胞凋亡,qPCR及WB显示IL-1β处理后的软骨细胞中MMP-13、ADAMTS-5发生了显著上调,而COL2A1发生了显著下调。更进一步地,IL-1β处理后的软骨细胞中lncRNA MEG3出现明显下调,miR-93出现显著上调;2.上调软骨细胞中LncRNA MEG3的表达后,MMP-13和ADAMTS-5的表达出现了显著性地下降,COL2A1表达出现显著性地上升,相反地,下调Lnc RNA MEG3的表达后,MMP-13、ADAMTS-5和COL2A1出现了与上调该基因相反的表达效果;3.lncRNA MEG3抑制miR-93表达,并间接上调TGFBR2的水平,同时miR-93抑制MEG3和TGFBR2的表达水平;4.MiR-93过表达可部分逆转MEG3上调对软骨细胞的凋亡和ECM降解的抑制作用。研究结论:LncRNA MEG3在IL-1β诱导的软骨细胞中低表达,并作为miR-93的ce RNA调节TGFBR2的表达,及软骨细胞凋亡、ECM降解等过程,最终影响OA的发生发展。本研究首次将MEG3和miR-93在骨关节炎中的相互作用进行了探索,通过多种检测手段最终提出了MEG3-miR-93-TGFBR2这一调控网络在OA发生发展过程中发挥的重要作用,对于理解OA的发生及临床应用提供了新的思路。