【摘 要】
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目的:1.建立H9c2细胞心肌重构模型并探索坎离颗粒对心肌重构的干预作用;2.建立Runx2基因敲除与过表达H9c2稳转细胞株模型,探索Runx2对心肌重构的作用以及坎离颗粒对Runx2蛋白表达的影响。方法:1.运用浓度为100n M血管紧张素Ⅱ刺激H9c2心肌细胞,建立心肌重构细胞模型,并分别在24h、48h、72h时,对H9c2进行细胞形态学观察,对心肌重构关键指标ANP、BNP、β-MHC、
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目的:1.建立H9c2细胞心肌重构模型并探索坎离颗粒对心肌重构的干预作用;2.建立Runx2基因敲除与过表达H9c2稳转细胞株模型,探索Runx2对心肌重构的作用以及坎离颗粒对Runx2蛋白表达的影响。方法:1.运用浓度为100n M血管紧张素Ⅱ刺激H9c2心肌细胞,建立心肌重构细胞模型,并分别在24h、48h、72h时,对H9c2进行细胞形态学观察,对心肌重构关键指标ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9、TIMP-1等进行蛋白表达量分析,以确定心肌重构最佳造模时间。2.通过细胞毒性实验,确定坎离颗粒用药无毒有效浓度区间,并在有效区间范围内,确定坎离颗粒用药的低、中、高浓度,并设立空白对照组,血管紧张素Ⅱ(模型组),低浓度坎离颗粒组(血管紧张素Ⅱ+低浓度坎离颗粒)、中浓度坎离颗粒组(血管紧张素Ⅱ+中浓度坎离颗粒)、高浓度坎离颗粒组(血管紧张素Ⅱ+高浓度坎离颗粒),观察坎离颗粒对心肌重构的干预作用及对Runx2蛋白表达的影响,并确定坎离颗粒最佳用药浓度。3.建立Runx2基因敲除与过表达的稳转细胞株,以正常H9c2细胞、Runx2基因敲除稳转细胞株及Runx2基因过表达稳转细胞株三种细胞模型为研究对象,以血管紧张素Ⅱ刺激三种细胞模型模拟心肌重构,以最佳浓度坎离颗粒为干预用药,探索Runx2对心肌重构的影响及对坎离颗粒对Runx2的影响。结果:1.血管紧张素Ⅱ刺激心肌细胞后,细胞体积增大,心肌重构关键指标ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9、TIMP-1蛋白表达升高,且在48小时促重构作用最为显著,同时血管紧张素Ⅱ上调了Runx2蛋白表达水平,在48小时最明显。2.细胞毒性实验结果提示:坎离颗粒的无毒有效剂量在0-100ug/ml之间,细胞存活率在90%以上。3.坎离颗粒可不同程度降低ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9、TIMP-1蛋白水平,抑制心肌重构,改善部分心脏功能,同时也使Runx2蛋白表达明显降低,且在浓度为25ug/ml时作用最为显著。4.构建Runx2基因敲除稳转细胞株:DNA测序结果显示Runx2的DNA序列在靶点位重复序列后双峰,蛋白质免疫印迹显示Runx2基本无蛋白表达,证明成功构建Runx2基因敲除的稳转细胞株。5.构建Runx2基因过表达稳转细胞株:RT-q PCR显示的Runx2的蛋白表达水平升高10倍以上,蛋白质免疫印迹显示Runx2蛋白表达显著升高,证明成功构建Runx2基因过表达的稳转细胞株。6.Runx2基因敲除后,与模型组相比,坎离颗粒干预后,BNP、MMP-1、MMP-9、TIMP-1蛋白表达量无明显降低;与正常H9c2细胞相比,Runx2敲除后,MMP-9/TIMP-1比率降低(P<0.05)。7.Runx2基因过表达后,与模型组相比,坎离颗粒干预后,其BNP、MMP-1、MMP-9、TIMP-1蛋白表达量显著降低;与正常H9c2细胞相比,Runx2过表达后,MMP-9/TIMP-1比率升高(P<0.05)。结论:1.血管紧张素Ⅱ刺激H9c2细胞48小时在一定程度上可以模拟心肌重构模型,并上调Runx2蛋白表达,发挥促心肌重构作用。2.坎离颗粒在一定程度上可以减轻血管紧张素Ⅱ的促心肌重构作用,并降低Runx2蛋白表达。3.Runx2基因敲除后,可减轻心肌重构程度,坎离颗粒干预作用不佳。4.Runx2基因过表达后,加重心肌重构程度,坎离颗粒干预作用显著。5.坎离颗粒对CHF具有良好疗效,其机制可能是通过降低心肌细胞中Runx2表达,进而抑制心肌重构,改善心衰症状。
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