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研究背景：肝移植已经成为治疗终末期肝病的有效方法，但目前原发性移植肝无功能仍可高达15％，肝移植仍然面临着免疫排斥的问题，为了解决这些问题，肝移植前选择性的对供体肝脏进行预处理是一种有价值的方法。研究表明，移植肝脏是否存活的关键因素之一在于肝脏内非实质细胞的功能。Kupffer细胞是肝脏非实质细胞的重要成员之一，在肝脏损伤的病理生理变化中扮演着重要的角色，Kupffer细胞可对移植肝起一定的保护作用；但其被激活后分泌的促炎性细胞因子又可导致移植肝的损伤，而且Kupffer细胞也参与了移植肝的免疫反应。在肝移植过程中Kupffer细胞的活化是一个普遍存在的现象，如何在强化Kupffer细胞对肝脏的保护功能的同时，避免或减轻其对肝脏的损害性作用，已成为这个领域的研究重点。在移植肝的再灌注过程中，Kupffer细胞可以被活性氧类化合物和类脂化合物所激活，使其释放如促凝血素、白三烯、前列腺素(prostaglandin，PG)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白介素(interleukin，IL)和蛋白酶等介导物质，Kupffer细胞还可上调MHCⅡ(主要组织相容性复合物Ⅱ)类抗原的表达，可引发白细胞和内皮细胞的粘连和抗原递呈，增强移植肝的抗体识别。因此对供体肝脏的Kupffer细胞进行处理，对移植肝脏的功能和免疫反应有什么样的影响是一个值得深入探讨的问题。已有动物实验表明，氯化钆可有效的抑制Kupffer细胞的活化，而对肝实质细胞、内皮细胞、体循环中的单核细胞和其它巨噬细胞功能无直接影响；甘氨酸是人体的一种非必需氨基酸，它除了对多种实体器官的缺血再灌注损伤有明显的保护作用外，对机体还有免疫抑制作用，近年来发现Kupffer细胞上存在甘氨酸受体。所以我们选择氯化钆和甘氨酸对供肝Kupffer细胞进行功能调节，研究其对肝移植后肝脏的功能和急性免疫排斥反应各有怎样的影响及其可能的机制，为进一步筛选不同调节剂调节Kupffer细胞功能，特异性地保护肝功能和减轻肝移植急性排斥的实验研究及临床应用提供依据和理论基础。目的：(1)第一部分：建立稳定大鼠原位肝移植模型，观察Wistard→Wistard和Wistard→SD大鼠模型的稳定性及是否符合实验要求，选择适宜可靠的大鼠原位肝移植免疫耐受和急性排斥模型。(2)第二部分：用氯化钆和甘氨酸处理供体Kupffer细胞，研究Kupffer细胞调节对肝移植后肝脏功能的影响，并探索其可能的作用机制。(3)第三部分：用氯化钆和甘氨酸处理供体Kupffer细胞，研究Kupffer细胞调节对肝移植急性免疫排斥反应的影响，探讨其可能的机制。通过以上三部分实验，为进一步筛选不同调节剂调节Kupffer细胞功能，特异性地保护肝功能和减轻肝移植急性排斥的实验研究及临床应用提供依据和理论基础。方法：(1)第一部分：参照Kamada“二袖套法”，加以适当改进，建立Wistard→Wistard和Wistard→SD大鼠原位肝移植动物模型，观察两组受鼠生存时间，测定术后3天、5天、7天血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)水平变化，并观察肝脏组织病理改变，对大鼠肝移植免疫耐受和免疫排斥模型进行评估。(2)第二部分：Wistard→Wistard肝移植大鼠分为三组，氯化钆组(供体大鼠术前24 h经尾静脉注射0.2％氯化钆溶液，10 mg／kg体重)、甘氨酸组(供体大鼠术前1h经尾静脉注射300mmol／L甘氨酸1.5ml)和对照组(供体大鼠术前1 h经尾静脉注射等渗生理盐水1.5ml)。每组分为两小组，8只观察生存率，8只进行实验检查。术后3天、5天和7天受体大鼠剖腹经肝上下腔静脉取血制成血清，取肝右前叶组织1cm~21块，制成电镜标本，术后3天的肝组织一部分进行肝细胞悬液的制备，剩余的肝组织立即固定、石蜡包埋。检测血清总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)与谷草转氨酶(AST)、细胞因子TNFα和IL-1，免疫组化法检测肝组织中Kupffer细胞FasL表达、流式细胞术检测移植肝的肝细胞凋亡率，并对相应的标本进行病理学光镜和Kupffer细胞电镜学观察。(3)第三部分：按上述方法建立Wistard→SD大鼠肝移植动物模型，实验动物分为三组：氯化钆组、甘氨酸组和对照组，供体预处理同方法(2)。每组肝移植分为两小组，8只观察生存率，8只进行实验检查研究。术后7天进行血浆中TBIL、ALT与AST水平、细胞因子TGF_β和IL-10、肝组织中Kupffer细胞FasL表达、移植肝脏的中淋巴细胞凋亡率，电镜下Kupffer细胞计数，并对相应的标本进行病理学观察。以上三部分数据以(?)±s表示，以SPSS软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有显著性。结果：(1)第一部分：Wistard→Wistar大鼠原位肝移植组完成38例，36例获得成功，1周存活率为70％；Wistard→SD大鼠肝移植免疫排斥组完成37例，33例手术获得成功，1周存活率为50％。Wistard→Wistar大鼠原位肝移植组术后ALT、AST、和TBIL逐渐下降，病理学检查未发现急性排斥反应，最长生存时间可达33天；而Wistard→SD组术后3-7天ALT、AST及TBIL呈逐渐上升，术后7天可见到明显的免疫排斥，排斥指数为7.06±0.78，最长生存时间12天。(2)第二部分：在免疫耐受研究中，改变供体Kupffer细胞功能后，氯化钆组和甘氨酸组1周生存率87.5％，对照组为75.0％；氯化钆组和甘氨酸的血清AST、ALT和TBIL的水平明显低于对照组；肝移植后氯化钆组IL-1水平低于对照组，而TNFα水平显著高于对照组，甘氨酸组的TNFα和IL-1水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；术后3天免疫组化染色显示，氯化钆组肝组织中Kupffer细胞存在散在的FasL蛋白表达；而甘氨酸组和对照组Kupffer细胞FasL表达均较高；术后3天Kupffer细胞FasL免疫组化染色阳性面积百分率分别为3.21±0.07％、7.03±0.86％和7.24±0.31％。氯化钆组与对照组比较存在显著的差异(P＜0.05)，而甘氨酸组与对照组无显著性差异。术后3天肝细胞凋亡凋亡率分别为：氯化钆组7.57±0.77％，甘氨酸组14.33±1.05％，对照组14.72±2.25％，氯化钆组同对照组相比有显著性差异，甘氨酸组和对照组相比无显著性差异。术后3天三组的病理学变化，以甘氨酸组炎性浸润最轻，氯化钆组次之，同对照组差异明显，电镜下观察同对照组相比，氯化钆组和甘氨酸组Kupffer细胞分泌功能均受到不同程度的抑制，以氯化钆组受抑制最明显。(3)第三部分：在急性排斥反应研究中，氯化钆组大鼠生存率明显降低，甘氨酸组生存率最高；经氯化钆处理后血清肝功能指标的水平显著高于对照组，而经甘氨酸处理后肝功能指标的水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；肝脏移植后7天甘氨酸组大鼠血清TGF_β最高，显著高于对照组，但IL-10的水平同对照组比较无显著性差异；而氯化钆组TGF_β和IL-10水平最低，同对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。免疫组织化学检测(SP法)显示，氯化钆组Kupffer细胞FasL免疫组化染色阳性面积百分率与对照组比较存在显著的差异(P＜0.05)，甘氨酸组和对照组相比无显著性差异。术后7天淋巴细胞凋亡凋亡率分别为：氯化钆组2.83±0.42％；甘氨酸组7.81±1.06％，对照组7.64±1.28％，氯化钆组同对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，甘氨酸组和对照组相比无显著性差异。在同样电镜倍数下对每组术后7天的标本进行Kupffer细胞的计数，氯化钆组为4.25±0.43，甘氨酸组为7.92±0.52，对照组为8.01±0.47，氯化钆组与对照组比较存在显著的差异(P＜0.05)，甘氨酸组与对照组比较无显著性差异。根据Banff排斥活动性指数积分，氯化钆组免疫排斥最重，甘氨酸组免疫排斥最轻，同对照组比较均有显著性差异。结论：(1)Wistard→Wistard大鼠原位肝移植组合是一种免疫耐受模型，Wistard→SD大鼠原位肝移植是一种中重度急性排斥模型，可用于肝移植免疫耐受和急性排斥的研究。(2)调节Kupffer细胞功能在免疫耐受和免疫排斥状态下均可影响肝移植肝脏的功能，这种影响是通过TNFα、TGF_β、IL-1和IL-10细胞因子的释放、Fas／FasL表达、细胞凋亡等多种机制实现的；(3)氯化钆调节供体Kupffer细胞功能对移植肝功能影响具有双重作用：一方面通过抑制Kupffer细胞功能降低炎性细胞因子IL-1释放、抑制FAS／FASL表达和肝细胞凋亡等保护移植肝脏功能；但另一方面其抑制Kupffer细胞功能后减少了下调免疫反应性细胞因子TGF_β和IL-10的释放、抑制了活化的T淋巴细胞凋亡，加重了肝移植急性排斥反应，其临床应用价值有限。(4)甘氨酸调节供体Kupffer细胞，一方面抑制了主要炎性细胞因子的释放，发挥对移植肝的保护作用，另一方面促进释放下调免疫性细胞因子TGF_β，抑制T淋巴细胞活化并减轻其细胞毒性作用，减轻了肝移植急性排斥反应，其临床应用价值较大，但需要进一步探索临床应用安全有效的剂量，甘氨酸对Kupffer细胞功能调节影响TGF_β和IL-10释放的机制，也需做深入研究。