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蓖麻是重要的油料作物,种子含油量高达46%~55%。蓖麻油由于其特殊的结构和物理化学性质,是一种用途十分广泛的化工原材料。蓖麻籽含有对人体有害的蓖麻毒素、蓖麻碱和过敏源,且病虫害较多,这些因素都影响了蓖麻的生产和应用规模的扩大。利用基因工程技术能够有效地解决上述问题。本论文一方面通过对7个蓖麻品种的两年探索和系统研究,创建了蓖麻花粉管通道转化新方法及技术程序;另一方面改进和优化蓖麻组培再生体系与遗传转化技术,取得了以下主要结果:
1、首先建立了蓖麻花粉管通道转化新方法及其技术流程。我们首先将花粉管通道法引入蓖麻研究,将含有gus基因的pJIT166质粒转入7个蓖麻栽培品种,转化的种子成熟后取其子叶进行GUS染色检测,以确定转化体数和转化频率。同时研究分析了不同受体品种、授粉方式(人工自交授粉和杂交授粉)和DNA导入时间等对转化效率的影响。运用该技术在2007和2008年分别收获转化种子1336粒和2258粒,经GUS染色检测获得的平均GUS阳性检出率分别达到6.44%和6.33%,两年结果很接近。研究发现,因蓖麻品种、授粉方式(自交或杂交)和滴注质粒DNA时间等不同其GUS阳性检出率均存在明显差异:在7个品种中以“哲蓖3号”的两年平均GUS阳性检出率最高(9.76%),而“2129”的平均GUS阳性检出率最低(1.26%);自交授粉的平均GUS阳性检出率(7.90%)高于杂交授粉(5.16%);授粉后4小时滴注DNA的平均GUS阳性检出率最高(8.71%),而授粉后6小时滴注的平均GUS阳性检出率最低(2.92%)。
2、改进、优化并建立了一套有效的蓖麻组织再生体系及相应的遗传转化技术体系。以3个蓖麻品种的成熟种子胚轴为外植体,在MS的芽诱导培养基上添加0.5mg/L6-BA时平均每个外植体产生6.3个不定芽,而改用0.5mg/L TDZ短期诱导后平均每个外植体所产生的不定芽多达30个。这些健壮的不定芽经伸长、生根而发育成完整的再生植株,并能全部移栽成活。因此改进并建立了一种以0.5mg/L TDZ短期诱导不定芽的高效再生体系,据此我们以Sujatha等(2005)建立的蓖麻胚轴转化方法为基础,通过采用多项改进措施,例如1)暗培养7天进行预处理;2)向共培养基中添加乙酰丁香酮并调低pH值为5.6;3)将诱导生根培养基中的低浓度生长素IBA或NAA替换成较高浓度的活性炭等,取得了较好的转化效果。运用该技术从来自8个受体品种的1264个外植体中共获得卡那霉素抗性植株72株,其中PCR检测呈阳性反应的有15株(表明nptⅡ基因已整合到蓖麻基因组中),平均PCR阳性检出率为1.2%,高于Sujatha等(2005)报道的转化频率(0.08%)。
本研究对于有效的开展蓖麻功能基因组研究和基因工程育种具有实际意义。