论文部分内容阅读
【研究背景】子痫前期（PE）是妊娠期特有的，以高血压、蛋白尿和水肿为主要特征的多器官损害性疾病，其发病率为2-8％，是导致孕产妇和胎儿死亡的主要原因之一。子痫是在子痫前期基础上发生的不能用其它原因解释的抽搐，终止妊娠通常是重度子痫前期/子痫的唯一有效治疗方法。 在过去的几十年里，子痫前期/子痫方面的研究获得了很大的进展，但其发病机制仍尚未阐明。近来，Th1/Th2/Th17型免疫反应失衡所致炎性反应改变被认为参与了子痫前期的发病机制。此外，本课题组前期关于类子痫模型的研究显示，炎性反应的增加，降低了子痫的抽搐阈值。虽然已有证据表明子痫前期/子痫与免疫改变所引起的母体过度炎性反应相关，但目前仍没有针对子痫前期有效的免疫炎性治疗。 环孢素A是一种免疫抑制剂，在临床上主要应用于器官移植及自身免疫性疾病。许多的研究显示了环孢素A对炎性因子的调节作用，并发现其在免疫炎性相关疾病中起到了保护作用。近来，更多的研究者开始关注环孢素A在妊娠相关免疫性疾病中的作用，如自然流产等。此外，有研究发现环孢素A对急性癫痫及再发癫痫的症状有缓解作用。 综上所述，思考如下问题：环孢素A是否能通过降低子痫前期大鼠模型的炎性反应来减轻高血压、蛋白尿等子痫前期的临床症状？环孢素A是否能通过降低子痫前期大鼠模型的炎性反应来缓解类子痫动物模型的抽搐行为？ 第一部分环孢素A对子痫前期动物模型的治疗作用 【目的】免疫抑制剂环孢素A是否能通过降低子痫前期大鼠模型的炎性反应来减轻高血压、蛋白尿等子痫前期的临床症状。 【材料与方法】 1、实验动物及分组 1)实验动物：SPF级8-10周龄SD雌性大鼠（约200-240g）经过隔离检疫并适应性喂养一周后按雌雄大鼠2:1进行合笼，次晨行阴道涂片，镜检发现精子者标记为妊娠第0天； 2)实验分组：38只大鼠随机分为5组 i.正常非孕对照组NPC（n=7）； ii.正常妊娠对照组PC（n=7）； iii.子痫前期模型组PE（n=8）； iv.5mg/kg环孢素A治疗组PE+CsA5（n=8）； v.10mg/kg环孢素A治疗组PE+CsA10（n=8）。 2、给药方法 1)子痫前期的建模：参照 Faas等人先前报道的实验方法利用极低剂量内毒素（l.0 ug/kg体重，生理盐水溶解配制稀释为2ml）于大鼠妊娠第14天采用微量注射泵由尾静脉缓慢泵入，建立子痫前期大鼠模型；正常非孕及正常妊娠对照组给予等量生理盐水2ml尾静脉注射。 2)环孢素A的干预：妊娠第16、17、18天，PE+CsA5、PE+CsA10两组大鼠分别予以5mg/kg，10mg/kg环孢素A腹腔注射。 3、评估指标 1)大鼠动脉收缩压测量：妊娠第7、11、14、16、19天上午9:00-12:00间通过无创尾套法测量大鼠血压，非孕大鼠的血压监测时间点按同批次孕鼠的相应妊娠时间进行。 2)大鼠24小时尿蛋白的检测：妊娠第12、19天通过代谢笼收集大鼠24小时尿蛋白，非孕大鼠的尿蛋白监测时间点按同批次孕鼠的相应妊娠时间进行。 3)大鼠肝肾功能检测：妊娠第20天麻醉大鼠，取下腔静脉血离心收集血清后采用全自动生化分析仪检测大鼠血清谷草氨酸转氨酶（AST）、谷丙氨酸转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的水平。 4)炎性指标检测：酶联免疫吸附试验 ELISA实验方法检测大鼠血清 Th1炎性因子TNF-α、INF-γ、IL-2、IL-6；Th2炎性因子IL-4、IL-10；Th17炎性因子IL17的表达水平。 5)妊娠结局评估：妊娠第20天终止妊娠，剖宫取胎对仔鼠及胎盘进行计数称重，记录可见的吸收胚胎及畸形胎儿个数，对结果进行统计分析。 4、统计学分析：采用SPSS13.0软件进行统计学分析，S-W方法进行正态性检验，正态分布计量资料用均数±标准误(x±s)表示，计数资料用百分数表示。各组间采用方差分析进行比较，方差齐性采用最小显著性差异检验（LSD），方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。重复测量的方差分析(analysis of variance for repeated measures)用于分析血压、尿蛋白指标；率的比较采用卡方检验或Fisher精确概率检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 【结果】 1、大鼠动脉收缩压（SBP）：妊娠第14天内毒素注射前各组大鼠基础血压无显著性差异，正常妊娠组妊娠期间血压无明显变化，且与非孕组血压无显著性差异。内毒素注射后妊娠第16天较同组妊娠第14天之前血压升高（124±1.2 VS103±0.9mmHg，128±1.6 VS105±0.5 mmHg，125±1.1 VS106±1.0 mmHg，p=0.000）；环孢素A腹腔注射后，两种剂量的处理组较子痫前期模型组血压下降（104±1.9 VS125±1.4 mmHg，105±0.8 VS125±1.4 mmHg，P=0.000）；孕19天两种剂量处理组间血压无明显差异。 2、大鼠24小时尿蛋白：内毒素尾静脉注射前，各组大鼠尿蛋白之间差异无统计学意义；内毒素注射后，妊娠第19天子痫前期模型组24小时尿蛋白含量明显升高（4763±165 VS2032±186 ug/24h，P=0.000），两种剂量环孢素A治疗组尿蛋白较子痫前期模型组降低。 3、大鼠肝肾功能指标：内毒素注射前后，各组大鼠临床生化指标（AST、ALT、SCr、 BUN）之间差异均无统计学意义。 4、大鼠血清炎性因子水平变化 1) Th1型炎性因子：子痫前期模型组炎性因子 IL-6较正常妊娠组、非孕对照组明显升高（105.82±4.02 VS49.00±4.02pg/ml，105.82±4.02 VS32.74±7.16pg/ml，P=0.000），环孢素A治疗组炎性因子IL-6较子痫前期模型组明显降低（59.34±7.59 VS105.82±4.02pg/ml，P=0.000；59.34±7.59 VS74.68±19.97pg/ml，P=0.003）；子痫前期模型组炎性因子TNF-α较正常妊娠组、非孕对照组明显升高（200.03±5.64 VS156.6±8.13pg/ml，P=0.005；200.03±5.64 VS144.19±9.83pg/ml，P=0.000），环孢素 A治疗组炎性因子 TNF-α较子痫前期模型组明显降低（154.37±15.32 VS200.03±5.64pg/ml，P=0.002）；子痫前期模型组炎性因子IFN-γ较正常妊娠组、非孕对照组明显升高（98.85±12.53 VS69.42±9.17pg/ml，P=0.000；98.85±12.53 VS38.57±3.81pg/ml，P=0.026），环孢素 A治疗组炎性因子 IFN-γ较子痫前期模型组明显降低（53.60±0.58 VS98.85±12.53pg/ml，P=0.001；65.76±6.62 VS98.85±12.53pg/ml，P=0.039）；各组间炎性因子IL-2均无明显差异。 2) Th2型炎性因子：子痫前期模型组抑炎性因子 IL-4表达水平较正常正常妊娠组、非孕对照组明显降低（1.72±0.07 VS3.05±0.41pg/ml，P=0.002；1.72±0.07 VS2.74±0.22pg/ml，P=0.020），环孢素A治疗组抑炎性因子IL-4较子痫前期模型组明显增高（3.11±0.32 VS1.72±0.07pg/ml，P=0.001；3.23±0.29 VS1.72±0.07pg/ml，P=0.001）。各组间炎性因子IL-10均无明显差异。 3) Th17型炎性因子：子痫前期模型组炎性因子 IL-17较正常妊娠组、非孕对照组明显升高（14.02±1.53 VS10.71±0.76pg/ml，P=0.023；14.02±1.53 VS9.60±0.96pg/ml，P=0.003），环孢素A治疗组炎性因子IL-17较子痫前期模型组明显降低。 5、妊娠结局：妊娠第20天，子痫前期模型组及两种剂量环孢素A治疗组较正常妊娠组胎儿重量均下降（3.5±0.06 VS4.4±0.07mg，P=0.000；3.8±0.06 VS4.4±0.07mg，P=0.000；4.2±0.07 VS4.4±0.07mg，P=0.046）。10mg/kg剂量环孢素A治疗组较5mg/kg剂量环孢素A治疗组胎儿重量增加（4.1±0.06 VS3.8±0.06 mg，P=0.000）；子痫前期模型组与正常妊娠组及环孢素A治疗组之间存活胎儿数、吸收胚胎及畸形胎儿个数无差异；子痫前期模型组与正常妊娠组及环孢素A治疗组之间胎盘重量无明显变化。 【结论】免疫抑制剂环孢素A通过调节促炎性因子及抗炎性因子之间的平衡，抑制了子痫前期大鼠模型的过度炎性反应状态，并改善了其临床症状。 第二部分 【目的】运用化学刺激（戊四氮腹腔注射诱导）的方法在子痫前期动物模型基础上建立一个能够模拟人类子痫发病特征的动物模型，并研究环孢素A对类子痫动物模型的预防作用。 【材料与方法】 1、实验动物及分组： 1)实验动物：SPF级8-10周龄SD雌性大鼠（约200-240g）经过隔离检疫并适应性喂养一周后按雌雄大鼠2:1进行合笼，次晨行阴道涂片，镜检发现精子者标记为妊娠第0天； 2)实验分组：23只大鼠随机分为3组 i.正常妊娠对照组P（n=7）； ii.子痫前期模型组PE（n=8）； iii.环孢素A预防组PE+CsA5（n=8）。 2、给药方法 1)子痫前期的建模：参照 Faas等人先前报道的实验方法利用极低剂量内毒素（l.0 ug/kg体重，生理盐水溶解配制稀释为2ml）于大鼠妊娠第14天采用微量注射泵由尾静脉缓慢泵入，建立子痫前期大鼠模型；正常非孕及正常妊娠对照组给予等量生理盐水2ml尾静脉注射。 2)环孢素A的干预：妊娠第16、17、18天，PE+CsA组大鼠予以5mg/kg环孢素A腹腔注射。 3)类子痫模型建立：妊娠第20天给予戊四氮40mg/kg腹腔注射建立类子痫抽搐模型。 3、评估指标 1)大鼠动脉收缩压测量：妊娠第14、16、19天上午9:00-12:00间通过无创尾套法测量大鼠血压，非孕大鼠的血压监测时间点按同批次孕鼠的相应妊娠时间进行。 2)大鼠24小时尿蛋白的检测：妊娠第12、19天通过代谢笼收集大鼠24小时尿蛋白，非孕大鼠的尿蛋白监测时间点按同批次孕鼠的相应妊娠时间进行。 3)抽搐行为记录：抽搐行为学分级参照Racine（1972）经典分级：1级：静止、凝视和咀嚼；2级：点头、湿狗样抖动(WDS)及面部抽动；3级：一侧前肢震颤；4级：站立、双侧前肢震颤及持续性点头；5级：全身性强直—阵挛性发作。观察时间给药后30分钟。记录指标包括，（1）抽搐潜伏期：给药后到发生1级抽搐的时间；（2）抽搐行为等级：大鼠所达最大抽搐等级。 4)炎性指标检测：妊娠第20天麻醉大鼠，取下腔静脉血离心收集血清后，酶联免疫吸附试验 ELISA实验方法检测大鼠血清炎性因子 TNF-α、IL-1β、IL-10、IL17的表达水平。 5)妊娠结局评估：妊娠第20天终止妊娠，剖宫取胎对仔鼠及胎盘进行计数称重，记录可见的吸收胚胎及畸形胎儿个数，对结果进行统计分析。 4、统计学分析：采用SPSS13.0软件进行统计学分析，S-W方法进行正态性检验，正态分布计量资料用均数±标准误(±s)表示，计数资料用百分数表示。各组间采用方差分析进行比较，方差齐性采用最小显著性差异检验（LSD），方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。重复测量的方差分析(analysis of variance for repeated measures)用于分析血压、尿蛋白指标；率的比较采用卡方检验或Fisher精确概率检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 【结果】 1、大鼠动脉收缩压（SBP）：内毒素注射后妊娠第16天较同组妊娠第14天之前血压升高；环孢素A腹腔注射后，处理组较子痫前期模型组血压下降。 2、大鼠24小时尿蛋白：内毒素尾静脉注射前，各组大鼠尿蛋白之间差异无统计学意义；内毒素注射后，妊娠第19天子痫前期模型组24小时尿蛋白含量明显升高，环孢素A处理组尿蛋白较子痫前期模型组降低。 3、大鼠抽搐行为学：子痫前期组较正常妊娠组抽搐潜伏期明显缩短；环孢素A预防组较子痫前期组抽搐潜伏期明显延长。子痫前期组较正常妊娠组抽搐等级评分明显升高（4.88 VS1.88，P=0.000）；环孢素A预防组较子痫前期组抽搐等级评分明显降低。 4、大鼠血清炎性因子水平变化： 1) Th1型炎性因子：子痫前期模型组炎性因子IL-1β较正常妊娠组明显升高，环孢素A处理组炎性因子IL-1β较子痫前期模型组明显降低；子痫前期模型组炎性因子 TNF-α较正常妊娠组明显升高，环孢素A处理组炎性因子TNF-α较子痫前期模型组明显降低。 2) Th2型炎性因子：各组间炎性因子IL-10均无明显差异。 3) Th17型炎性因子：子痫前期模型组炎性因子 IL-17较正常妊娠组明显升高，环孢素A处理组炎性因子 IL-17较子痫前期模型组明显降低。 5、妊娠结局：妊娠第20天，子痫前期模型组及环孢素A处理组较正常妊娠组胎儿重量均下降；子痫前期模型组与环孢素 A处理组胎儿重量无统计学差异；子痫前期模型组及环孢素A处理组较正常妊娠组胚胎吸收率增加；子痫前期模型组与正常妊娠组及环孢素 A处理组之间胎盘重量无明显变化。 【结论】本研究发现免疫抑制剂环孢素A在一定程度上提高了戊四氮所致类子痫模型的抽搐阈值，提示免疫抑制和抗炎性反应治疗有可能成为防治子痫的一种选择。