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本论文以两种鲤科鱼类,鲤鱼和草鱼为研究对象,对它们的免疫机制(特别是硬骨鱼类天然免疫机制)进行了研究,分以下两个部分来简述:
前期以鲤鱼为实验材料,在4月龄F3代转基因鱼胸腺发育差减cDNA文库中,筛选并鉴定了与胸腺发育相关的81个与已知基因同源的表达序列标签(EST)。应用RT-PCR和虚拟Northern杂交技术进一步证实其中的若干基因在转基因鱼胸腺组织中的表达量增加。从其中挑选出3个免疫相关差异表达基因SLP-76,NKEF-B,和GzmA/K EST。通过RACE和Genome Walking方法获得这3个基因的cDNA全长、包括启动子区的基因组序列。以此为基础,我们对这3个基因进行了序列分析、分子结构预测、进化树及组织表达定位分析。结果显示:鲤鱼SLP-76基因cDNA全长2007bp,编码285个氨基酸。基因组序列长9.2Kb,由21个外显子和20个内含子组成。SLP-76氨基酸序列包括一个Gads结合位点R-X-X-K,一个Gads结合位点上游10个氨基酸序列区,和一个保守的重复3次包含酪氨酸的序列(DYE(S/N/P)P)。这些结构域在其它物种SLP-76中的高度保守性说明了鲤鱼SLP-76可能与人和小鼠SLP-76有着相似的功能。进化分析发现它与斑马鱼SLP显示最高的相似性,两者在SLP-76部分形成一支。另外发现SLP-76主要在造血组织中表达,并且与12月龄鲤鱼相比较,4月龄鲤鱼胸腺中SLP-76表达上调；与4月龄正常胸腺相比较,4月龄转基因胸腺中SLP-76表达也上调。鲤鱼NKEF-B基因cDNA全长1022bp,编码197个氨基酸。基因组序列长5.1Kb,由6个外显子和5个内含子组成。NKEF-B氨基酸序列包含2个保守的Val-Cys-Pro(VCP)基序和3个保守的半胱氨酸残基。进化树中它与硬骨鱼NKEF-B聚于NKEF-B一支。健康鲤鱼中NKEF-B主要在肾和头肾中表达。SVCV感染情况下,它在血,鳃,肠和脾中表达显著增加。利用重组NKEF-B多抗,免疫组化分析进一步发现NKEF-B主要分布在红细胞,鳃和肠的上皮细胞,并且感染情况下,鳃和脾的切片中这些阳性细胞和胞质阳性产物明显增加。鲤鱼GzmA/K基因cDNA全长1053bp,编码257个氨基酸。基因组序列长5.4Kb,由5个外显子和4个内含子组成。GzmA/K氨基酸序列包括了几个重要的结构域和残基,分别是N端信号肽,8个半胱氨酸残基,作为活化位点中心元件的3个保守残基,和一个高度保守的IIGG基序。进化树中它与之前报道的鱼类和鸟类GzmA/K形成一个单独的区域。GzmA/K主要表达于免疫组织,并且在转基因鲤鱼胸腺中表达上调。SVCV感染情况下,它在大部分免疫组织中的表达均上调。
基于天然免疫在病原微生物初期感染的重要防御作用和鱼类抗病研究的深入,后期进行的研究工作是:阐明两对在天然免疫信号通路中发挥重要作用的基因在鱼类天然免疫中所起的作用及其机制。这两对基因一对来自TLR通路:Tollip和IRAK-1,一对来自PKR通路:PKR和Prkripl。首先通过对草鱼头肾cDNA文库的筛选,同源克隆和RACE克隆的方法获得这4个基因的全长cDNA序列,它们的cDNA序列长度分别为:Tollipl,1325bp；IRAK-1,3976bp；PKR,2898bp；Prkripl,1057bp。进而利用Genome Walking的方法获得了它们的基因组DNA序列(包括启动子)。以此为基础,我们对这4个基因进行了序列分析和分子结构预测,进化树分析。为了进一步研究基因功能,我们将其中3个基因进行原核表达、纯化、制备多克隆抗体,并将通过免疫组织化学和免疫荧光共聚焦分析研究它们在细胞内的分布和共定位。此外,我们还构建了启动子融合GFP和RFP的真核表达质粒,通过转基因的方法研究其在胚胎发育期所受的表达调控,前期检测已证实克隆出的4个基因启动子均具有活性,并观察到Tollip和IRAK-1在胚胎发育早期就有共定位,随后这两个基因的共定位现象迁移至后脑区。同时,我们正在利用一种新的BiFC技术和模式动物斑马鱼,研究这两对基因在细胞内的相互作用。目前相互作用的分析实验正在进展中。
以上结果揭示了鲤鱼SLP-76,NKEF-B,和GzmA/K3个基因的分子结构和表达特征,发现SLP-76的表达水平可能涉及到硬骨鱼类的胸腺发育,GzmA/K和NKEF-B可能参与了硬骨鱼类抗病毒感染的潜在功能。同时也揭示出草鱼两对基因(Tollipl和IRAK-1,PKR和Prkripl)分别在TLR通路和PKR通路中的调控关系及其相互作用机制。这些研究除提供一个了解免疫基因分子结构和进化特征的视野外,还探讨了鱼类T细胞发育,Tc和NK细胞活化的分子基础及其与抗病毒免疫反应的关系。通过最终的实验结果分析,我们将会对鱼类特别是鲤科鱼类的天然免疫机制有更多的认识。