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火焰兰(Renanthera Lour)是一类具较高观赏价值但尚未受到足够重视和商业开发利用的兰科植物。火焰兰野生植株数量较小,受“野生动植物濒危物种国际贸易公约”(CITES)保护而被限制交易,因此开展火焰兰的育种研究、育出观赏价值高的新品种适合市场需要具有重要的现实意义。本研究在收集了10种火焰兰属原生种和40种近缘属原种种质、在广州地区进行保育栽培和相应评价、建立起火焰兰种质资源库的基础上,应用现代生物技术结合传统的杂交育种方法创制了火焰兰新种质和并培育出了新品种,取得了研究结果如下:
1.应用4℃低温成功地保存了云南火焰兰花粉。实验结果显示,在4℃的低温条件下保存330 d的花粉仍有活力,用保存的花粉授粉可得到高达80%的结果率。这个结果表明低温存储花粉的方法可有效解决火焰兰杂交育种中花期不遇的问题。
2.建立了火焰兰非共生萌发的培养技术体系,为火焰兰杂交育种和种苗繁殖奠定了必要的技术基础。通过多种因素对火焰兰种子离体发育的影响的研究,确定RG为火焰兰种子萌发的通用培养基,用此培养基播种火焰兰,30d时统计萌发率可达70-95%;RS1为萌发种子发育成苗的培养基,用此培养基培养60d的成苗率达50%以上。
3.以火焰兰为亲本,开展属内属间的杂交育种试验。结果表明,火焰兰具有较高的杂交亲和性,能与供试的多个属内原种和多个属间原种杂交成功获得后代种子。与火焰兰进行属间杂交成功的属包括万代兰属、拟万代兰属、五唇兰属、蝴蝶兰属、湿唇兰属、兰属;火焰兰属内种间杂交成功的组合有10个。目前已获得6个组合的杂交后代,其中3个组合已开花并进行了国际新品种登录。
4.采用一步成苗培养法进行火焰兰和火焰兰杂种种子无菌播种成苗实验,结果表明一步成苗培养法比常规方法的培养成苗时间缩短60-85d。一步成苗培养法减少了1次以上接种转移操作,由此而提高了火焰兰杂交育种的工作效率。
5.以引物OPA1进行火焰兰杂种的分子鉴定,结果显示父母本的特征条带大多可以结合到杂种的谱带中,证明RAPD可以有效地对火焰兰的杂种进行早期鉴定。火焰兰杂交后代的花葶高度、花朵数和花径大小属于数量性状。
6.建立了火焰兰无性克隆和新品种开发技术体系。以云南火焰兰与豹斑火焰兰杂种后代叶片和茎尖为外植体进行离体快繁及其商品化生产技术的研究,结果表明:BA诱导外植体形成PLB的效果优于KT和TDZ;诱导得到的PLB在培养基RB1上培养30d后增殖率达2.33倍;在培养基RR1上培养60d有95%实现芽的分化,75%的PLB可形成完整幼苗;幼苗出瓶移栽成活率在95%以上。
7.应用建立的无性克隆快繁技术体系,开展了经广东省新品种审定的“麒麟火焰兰”的批量组培繁殖;应用配制的火焰兰专用肥能使植株生长旺盛抗逆性强,成龄植株双花枝率和花朵数大幅度增加:通过低温催花处理可使93.75%麒麟火焰兰在春节期间应节开花。
8.以云南火焰兰为材料,开展了用秋水仙素为诱变剂的火焰兰多倍体诱导试验。结果表明,用浓度为0.10%的秋水仙素溶液处理原球茎48h的诱变率最高,而过高的秋水仙素浓度和过长的浸泡处理时间都会加重对原球茎的毒害作用,造成较高的死亡率。经观察统计火焰兰组培体细胞变异率约为0.2%,共获得15株火焰兰变异株。
9.构建了墨兰CO基因超表达载体,利用农杆菌介导法开展了火焰兰遗传转化研究。结果表明:通过AS活化的高毒农杆菌菌株EHA105可以高效地将T-DNA转入受体细胞;潮霉素和GUS可作为火焰兰转化的选择剂和报告基因;火焰兰种子萌发后形成的幼嫩原球茎可作为转化受体材料,GUS瞬时表达率达到24.1%。
10.建立起火焰兰种质资源种子保存和无菌苗离体保存技术体系。云南火焰兰的种子在4℃和避光条件下保存4a其无菌播种萌发率仍可达85%;云南火焰兰的无菌实生苗在通常培养室温度条件下于培养基RC1培养3a其存活率仍可达90%以上。以此无菌苗的顶芽和根为外植体建立了再生体系,染色体检测证明再生苗的染色体数目没有发生变化。