论文部分内容阅读
目的:探讨大麻素2型受体(CB2R)在脓毒症急性肺损伤中的作用及其与自噬的关系。方法:(1)将24只8-10周龄,体重20～25 g的SPF级雄性C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为4组(n=6):假手术组(Sham组)、脓毒症组(CLP组)、脓毒症+大麻素2型受体激动剂HU308组(CLP+HU308组)、脓毒症+大麻素2型受体激动剂HU308+3-甲基腺苷组(CLP+HU308+3-MA组)。采用盲肠结扎穿孔法构建脓毒症模型,CLP+HU308组和CLP+HU308+3-MA组于术后15min时腹腔注射HU308 2.5 mg/kg,15min后CLP+HU308+3-MA组腹腔注射3-MA 10 mg/kg。术后12 h后收集肺组织,HE染色观察各组肺组织病理学变化,并进行肺损伤评分,采用RT-PCR法检测肺组织中CB2R、TNF-α、IL-18和IL-1βmRNA的表达水平,采用免疫组织化学法测定自噬相关蛋白Atg5的表达,采用Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1和p62的表达水平,计算LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的比值(LC3Ⅱ/Ⅰ比值)。(2)将巨噬细胞以1×10~5/ml的密度接种于6孔培养板中(2ml/孔),采用随机数字表法分为4组(n=6):对照组(C组)、LPS组(LPS组)、LPS+CB2R激动剂HU308组(LPS+HU308组)、LPS+CB2R激动剂HU308+3-甲基腺苷组(LPS+HU308+3-MA组)。LPS组、LPS+HU308组和LPS+HU308+3-MA组加入终浓度为1ug/ml的LPS,孵育15min时,LPS+HU308+3-MA组加入终浓度为10mM的3-MA,继续孵育15min,LPS+HU308组和LPS+HU308+3-MA组加入终浓度为10μM的HU308孵育24h。采用ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度,采用RT-PCR法检测CB2R、NLRP3和Atg5 mRNA的表达水平,采用western blot法检测LC3、Beclin1和p62的表达水平,计算LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的比值(LC3Ⅱ/Ⅰ比值),采用免疫荧光法检测NLRP3蛋白的表达水平。结果:(1)与Sham组比较,CLP组CB2R mRNA表达增多(P<0.05),肺损伤评分、TNF-α、IL-18和IL-1βmRNA表达升高(P<0.05),Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin1表达上调(P<0.05),p62表达下调(P<0.05);使用HU308激活CB2R后CB2R mRNA表达无显著性差异(P>0.05),肺损伤评分、TNF-α、IL-18和IL-1βmRNA的表达水平降低(P<0.05),Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin1表达上调(P<0.05),p62表达下调(P<0.05);使用3-MA抑制自噬后CB2R mRNA表达无显著性差异(P>0.05),肺损伤评分、TNF-α、IL-18和IL-1βmRNA的表达水平升高(P<0.05),Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin1表达下调(P<0.05),p62表达上调(P<0.05)。(2)与C组比较,LPS组CB2R mRNA表达增多,上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度升高(P<0.05),Atg5 mRNA、LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin1表达上调(P<0.05),p62表达下调(P<0.05),NLRP3表达增多;使用HU308激活CB2R后CB2R mRNA表达无显著性差异(P>0.05),上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度降低(P<0.05),Atg5 mRNA、LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin1表达上调(P<0.05),p62表达下调(P<0.05),NLRP3表达减少;抑制自噬后CB2R mRNA表达无显著性差异(P>0.05),上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18的浓度升高(P<0.05),Atg5 mRNA、LC3Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin1表达下调(P<0.05),p62表达上调(P<0.05),NLRP3表达增多。结论:激活大麻素2型受体可减轻脓毒症急性肺损伤,其作用机制可能与增强自噬抑制炎症反应有关。