【摘 要】
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体细胞核移植技术已经被广泛应用,但是克隆效率低下一直是制约克隆技术发展的主要原因之一。有研究表明,克隆效率低下是由于克隆胚胎中X染色体异常失活导致的,在小鼠中通过敲
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体细胞核移植技术已经被广泛应用,但是克隆效率低下一直是制约克隆技术发展的主要原因之一。有研究表明,克隆效率低下是由于克隆胚胎中X染色体异常失活导致的,在小鼠中通过敲除供体细胞XIST基因或者利用RNAi技术干扰早期胚胎中XIST基因表达,均能显著提高小鼠的克隆效率。尽管在小鼠上通过基因敲除和RNAi技术抑制XIST基因表达均可以显著提高小鼠克隆胚胎发育效率,但两种方法能否提高猪克隆胚胎发育效率仍然未知。本论文以两种猪体细胞,包括野生型公猪PK细胞(WT)和本实验室前期获得的XIST基因敲除公猪PK细胞(KO)为材料作为供体细胞进行核移植,收集桑葚胚时期两组胚胎,通过转录组测序比较处理组与对照组胚胎基因表达差异。本试验同时比较了突变XIST基因胚胎相较于野生型对照组胚胎的体内发育效率。本试验同时针对猪XIST基因设计了四组小干扰RNA靶序列,筛选了最佳的干扰序列,使用最佳干扰序列合成了普通的siRNA,化学修饰的siRNA,并构建了表达靶向序列发夹结构的质粒表达载体,筛选了干扰作用时间最长的干扰形式。在猪核移植胚胎二细胞期进行包浆注射,对照组注射等体积的水,比较注射组胚胎体外发育效率及相关基因表达情况。本试验获得如下结果:(1)shRNA质粒表达载体转染细胞,其干扰效果持续时间最久,化学修饰的siRNA干扰效率最低;(2)二细胞期注射shRNA质粒表达载体,在囊胚期仍然可以有效干扰XIST基因表达(P<0.05),且显著提高了X染色体连锁基因表达量(P<0.05);(3)二细胞期注射10p L 5ng/μL shRNA质粒表达载体,显著抑制了XIST基因表达水平(P<0.05),但是相较于对照组,其平均囊胚细胞数和囊胚率没有显著差异;(4)以敲除XIST基因的细胞系做供体细胞,显著提高了克隆胚胎中X染色体连锁基因的表达水平(P<0.05);(5)用通过敲入neo-EGFP外源基因突变XIST基因的细胞系做供体细胞,降低了体外培养和体内发育胚胎的发育效率(P<0.05)。以上结果表明,以突变XIST基因作供体细胞做核移植,显著提高了X染色体基因表达水平,但降低了体内发育效率,其原因可能是由于供体细胞经历了长期的G418药物筛选导致。在二细胞期包浆注射靶向XIST基因的shRNA质粒表达载体,在囊胚期可以有效抑制XIST基因的表达,但是囊胚细胞数和囊胚率相较于对照组没有显著差异,其原因可能是由于XIST基因表达模式的种间差异。
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