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木质素过氧化物酶是一种重要的具有工业应用前景的木质素降解酶,但已报道真菌来源的木质素过氧化物酶只能在酸性低温条件下发挥作用,限制了其进一步的工业应用。本研究通过分离纯化、蛋白质归类鉴定及生物信息学分析,获得一种具有耐热耐碱特性的木质素过氧化物酶并研究其蛋白质内部信息,为研究其耐热耐碱机理、降解木质素的机理及编码该种蛋白的基因提供理论依据,对后续的该酶基因改造及工业应用具有重要意义。
本研究通过培养一株耐热耐碱放线菌-绿色糖单孢菌,在前期最佳发酵产酶条件探索的基础上,采用16 L发酵罐对该菌进行诱导产木质素过氧化物酶;通过硫酸铵盐析沉淀、透析得到粗酶液;采用DEAE-Cellulose,CM-Cellulose和Superdex75凝胶过滤层析等分离纯化方法,得到一种具有耐热耐碱特性的木质素过氧化物酶。其中:DEAE-Cellulose的纯化倍数为3.8,CM-Cellulose的纯化倍数为5.9,Superdex75的纯化倍数为10.3,可知Superdex75的纯化效率最高。经凝胶电泳检测其为单一蛋白,分子量为41 kDa。最终纯化倍数达到20倍,活性回收率为6％。
对蛋白质进行N端测序,结果表明该酶蛋白的N端封闭,不能获取有效的蛋白质内部信息。根据蛋白质归类鉴定的方法,用蛋白质内切酶对目的蛋白进行内部酶切,酶切后的混合多肽在LTQ分析仪上分析,分析结果与NCBI上已发表的木质素过氧化物酶进行比对,得到一段有效的蛋白质一级结构。对该一级结构进行了生物信息学分析及预测研究,主要包括:蛋白质的基本理化性质、信号肽预测、亲水性/疏水性分析、跨膜结构域预测,蛋白质二级结构的详细分析,进一步模拟了该蛋白质的三级结构。在此基础上还分析了该种酶蛋白在系统发育中的进化关系。生物信息学分析结果表明:绿色糖单孢菌来源的木质素过氧化物酶具有植物过氧化物酶超家族的典型特点,属于稳定性蛋白,催化活性中心具有高度的保守性;具有信号肽,属于亲水性蛋白质,具有跨膜区域;蛋白质的二级结构归类于全a折叠型;三级结构与模板的同源性很低,还需要进一步使用更精确的建模软件对该蛋白的三级结构进行模拟构建。