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第一部分细胞衰老相关因子在骨髓增生异常综合征恶性进展和预后评估中的作用研究 目的： 骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndromes，MDS）是起源于骨髓造血干细胞的异质性克隆性疾病，具有向急性髓系白血病演变的高风险。本实验旨在研究细胞衰老相关因子p16INK4a和β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）等在骨髓增生异常综合征患者恶性进展及预后评估中的作用，探讨MDS的发病机制。 方法： 1.细胞衰老检测：采用生物化学法进行衰老生物学标志β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的染色检查，光镜下观察，SA-β-gal阳性表达细胞显示蓝色，随机选取细胞分布均匀的5个高倍视野共500个细胞进行观察，计数SA-β-gal染色阳性细胞数，计算染色阳性细胞比率。 2.应用实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测患者P16INK4a和SA-β-gal等细胞衰老相关因子mRNA表达水平、衰老活性（53例MDS患者，11名对照以及12例急性髓系白血病患者）。其中，磁珠分选患者骨髓CD34+细胞7例， CD34+细胞对照组3例，其余均为骨髓单个核细胞，分析临床资料及MDS患者细胞衰老因子表达水平与WPSS评分、危险度分组的关系。 3.采用western-blot及免疫荧光技术检测患者p16mRNA蛋白表达，分析MDS患者蛋白表达水平与WPSS评分及危险度分组的关系，进行MDS恶性进展和预后评估分析。 结果： MDS组SA-β-gal阳性细胞数明显高于对照组(p＜0.01)，AML组SA-β-gal阳性细胞数明显低于对照组(p＜0.05);在骨髓单个核细胞（BMMNCs）/CD34+细胞中， MDS患者 P16mRNA表达水平明显高于正常对照组。p16mRNA/abl MDS组为0.1477±0.1852，正常对照组为0.0709±0.0995，AML组为0.0086±0.0047。MDS组明显高于正常对照组，P<0.05，具有统计学意义。AML组 p16mRNA水平明显低于正常对照组,P<0.01,具有统计学意义。在MDS病人中p16mRNA的表达率与WPSS评分成负相关（R2=-0.234）;应用western blot检测，阳性对照HeLa细胞表达最强，MDS较强，AML表达最弱，MDS患者BMMNCs的p16INK4a蛋白表达比正常对照组明显增高(P<0.05)；采用免疫荧光技术检测 MDS组、正常对照组及 AML组患者的p16INK4a蛋白表达情况。结果提示：MDS组、正常对照组至AML组p16INK4a蛋白表达水平逐渐下降，与p16INK4a mRNA表达趋势基本一致。 结论： MDS患者BMMNCs和CD34+细胞衰老水平升高；p16INK4a和SA-β-gal等衰老因子表达与WPSS积分、危险度分组呈负相关，衰老因子表达水平与MDS患者预后负相关。在MDS的恶性进展中有衰老机制的参与，P16INK4a-Rb信号通路的激活可能是细胞衰老的机制。 第二部分自噬相关因子在骨髓增生异常综合征恶性进展和预后评估中的作用研究 目的： 本实验旨在研究自噬相关基因LC3B、Beclin1、UVRAG等在骨髓增生异常综合征患者恶性进展及预后评估中的作用，探讨MDS的发病机制。 方法： 1.应用透射电子显微镜检测患者骨髓单个核细胞自噬情况。 2.实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测不同白血病细胞株、低危MDS组、高危MDS组、急性髓系白血病患者(De novo AML)及非恶性病贫血（NM）患者LC3B、Beclin1、UVRAG、bcl-2等基因mRNA表达水平，分析临床资料及MDS患者自噬因子表达水平与危险度分组、WPSS评分的关系。 3.采用western-blot技术及免疫荧光技术检测患者LC3B、Beclin1等蛋白表达，分析MDS患者蛋白表达水平与危险度分组、WPSS评分的关系。 4.采用流式细胞术(FCM)检测22例MDS患者、9例AML及17例NM患者骨髓CD34+细胞自噬活性，并分析其与WPSS评分的关系。 5.化学合成靶向 Bcl-2基因的siRNA，脂质体法将 siRNA转染 HL-60细胞， RT-PCR检测RNA干扰前后Bcl-2、LC3、Beclin-1mRNA、蛋白的表达水平，检测自噬活性；MTT法检测细胞增殖；流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率。 结果： 低危MDS患者BMMNCs内易见自噬泡，显示MDS患者BMMNCs含自噬泡数量显著高于NM、AML组（P<0．05）；NM组及低危MDS患者BMMNCs LC3B、UVRAG mRNA表达水平显著高于高危MDS及AML组(P<0．05)，Beclin-1在低危MDS组高表达，而Bcl-2在高危MDS和AML组高表达，二者在MDS中表达呈负相关；LC3B、Beclin-1及UVRAG mRNA表达水平与MDS患者危险度分组、WPSS评分呈负相关。蛋白免疫印迹法显示低危MDS患者BMMNCs LC3B、Beclin-1蛋白表达高于高危 MDS组及 AML组，均有统计学意义(P<0．05)；高危 MDS与 AML比较差异无统计学意义(P>0．05)。患者 CD34+细胞自噬活性检测显示，低危 MDS组高于高危MDS组及AML组(P<0.05)；骨髓CD34+细胞自噬活性与MDS患者危险度分组、WPSS评分呈负相关。Bc1-2-siRNA转染HL-60细胞后，细胞自噬因子表达升高，细胞凋亡增加，抑制了肿瘤细胞增殖。 结论： 低危MDS患者BMMNCs和CD34+细胞自噬水平升高；LC3B、Beclin1、UVRAG等自噬因子与MDS患者预后负相关；Beclin-1和Bcl-2表达在不同危险度分组的MDS患者中负相关，可作为恶性进展和预后评估的指标； MDS的恶性进展可能与自噬水平相对不足有关。肿瘤细胞通过上调自噬因子Beclin-1表达，使自噬活性增强；肿瘤细胞通过Bc1-2/Beclin-1复合体信号通路调节自噬。