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鼻咽癌是我国南方多发的一种与Epstein-Barr(EB)病毒密切相关的恶性肿瘤，当诊断为鼻咽癌时大多已为中晚期。临床上治疗鼻咽癌，单纯放疗5年生存率一直徘徊在20％～50％，尤其是颈部淋巴结转移的肿瘤疗效更差。然而化疗和放疗联合治疗不能显著提高患者的生存率，并且放化疗较单纯放疗有更多严重的毒副反应，所以人们期待新的治疗策略的研究，从而改善患者的生活质量，提高患者的生存率。丁酸钠(sodium butyrate，NaB)是膳食纤维在肠道中酵解后产生的一种无毒四碳链脂肪酸。最近研究证明丁酸钠是一种有潜力的抗肿瘤药，能抑制多种肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，如结肠癌、食管癌、肝癌、骨髓瘤等多种肿瘤。本研究对NaB作为潜在的鼻咽癌治疗药物的作用方式，及其作用机制进行了探讨。
第一部分丁酸钠增强EB病毒阳性肿瘤细胞对更昔洛韦敏感性的机制研究
多年来的病理学研究发现鼻咽痛与EB病毒(EBV)密切相关，几乎所有病人的未分化型鼻咽癌组织中均存在EB病毒基因组，鼻咽癌肿瘤细胞内存在EBV的这种特征为其临床治疗提供了靶点。许多研究者利用EBV含有自杀基因的特点提出了多种杀死EBV阳性肿瘤细胞的策略。EBV基因组中含有自杀基因胸苷激酶(Thymidine kinase，TK)基因，是一种EBV裂解期大量表达的蛋白，TK能磷酸化丙氧鸟苷(Ganciclovir，GCV)又称更昔洛韦，磷酸化后的丙氧鸟昔能抑制病毒DNA合成酶的活性，同时也抑制肿瘤细胞DNA的合成，选择性地杀伤快速增殖的肿瘤细胞从而引起细胞夕E亡。然而，鼻咽癌肿瘤细胞中的EBV-TK基因往往处于沉默状态，许多研究表明丁酸钠能诱导EBV从潜伏期进入裂解期表达大量的TK。并且，临床研究发现GCV与丁酸钠的联合使用能增强GCV对EBV相关肿瘤的细胞毒性。但此时丁酸钠的使用需要较大剂量才能到达药物的有效浓度。为了减少丁酸钠的用药量，提高EBV相关肿瘤细胞对GCV与丁酸钠联合用药的敏感性，我们从诱导EBV进入裂解期的细胞内信号传导方面探讨了提高其联合用药的途径。
目的：
为了提高EBV阳性肿瘤细胞对丁酸钠和更昔洛韦联合用药的敏感性，降低临床上丁酸钠的用药量，本研究通过干扰B95-8细胞内信号通路探讨了增强丁酸钠和更昔洛韦联合用药的途径，为临床治疗EBV阳性肿瘤提供了可行的治疗策略。
方法：
1.MTT检测GCV对B95-8细胞的细胞毒性。
2.MTT检测GCV和NaB联合应用对B95-8细胞的细胞毒性。在96孔板中培养B95-8细胞，分两组实验。一组培养基中仅加入不同浓度的GCV，另一组先加入NaB，18h后加入GCV，共孵育6天。通过MTT检测GCV单独作用与GCV和NaB联合作用这两种条件下细胞的存活率。此外，通过MTT检测NaB单独作用时B95-8细胞的存活率。
3.不同浓度的NaB与B95-8细胞共孵育24h后，用鼻咽癌病人的血清作为一抗，通过Western Blot检测B95-8细胞内TK蛋白的表达。
4.干扰B95-8细胞内信号通路，探讨增强GCV和NaB联合用药的途径。向B95-8细胞内分别转入Ras蛋白的抑制剂质粒pCMV/Ras N17、Raf蛋白的抑制剂pCMV/Raf S621A、Akt蛋白的抑制剂pCMV/AktDN、MEKK1蛋白激活剂(pCMV/MEKK1)，12h后加入1mM的NaB，18h后再与100μg/ml的GCV共孵育，连续培养3天或6天。对照组转入质粒pcDNA3.1。利用MTT检测细胞存活率。此外，在B95-8细胞孵育NaB24h后，通过Western Blot检测TK蛋白表达情况。
结果：
1.B95-8细胞与不同浓度的GCV进行共孵育，MTT检测结果显示单独的GCV对B95-8细胞的细胞毒性不显著。当GCV达到100μg/ml时，对B95-8细胞的杀伤作用才开始出现。此时GCV对细胞生长的抑制率为27.3％，200μg/ml时为29.0％，400μg/ml为38.3％。
2.GCV与NaB联合作用对B95-8细胞的细胞毒性比较显著，当GCV为100μg/ml时了，两者联合对细胞生长抑制率可达58％，而NaB单独作用于B95-8细胞时没有细胞毒性。从而表明NaB能增强GCV对B95-8细胞的细胞毒性作用。
3.Western Blot检测结果显示NaB能增强B95-8细胞内EBV-TK的表达，随着NaB浓度增大TK表达增多。由于TK是B95-8细胞内EBV裂解期的产物，推测NaB诱导EBV进入裂解期并表达大量的TK。
4.为了提高B95-8细胞对GCV和NaB联合用药的敏感性，我们分析了B95-8细胞内的三条信号传导通路，结果显示阻断Ras/Raf不能提高B95-8细胞对GCV和NaB的敏感性；阻断AKT能提高B95-8细胞对GCV和NaB的敏感性，而TK表达没有变化；激活MEKK1能提高B95-8细胞对GCV和NaB的敏感性，并且TK表达显著增多。从而推测阻断AKT增强GCV和NaB药理作用的机制和TK无关；激活MEKK1增强GCV和NaB对B95-8细胞毒性的机制可能是TK依赖的。
结论：
为了提高EBV阳性肿瘤细胞对丁酸钠和更昔洛韦联合用药的敏感性，降低临床上丁酸钠的用药量。本研究通过干扰B95-8细胞内信号通路探讨了增强丁酸钠和更昔洛韦联合用药的途径，发现阻断AKT或激活MEKK1能提高B95-8细胞对GCV和NaB的敏感性，为临床治疗EBV相关肿瘤提供了可行的治疗策略。
第二部分、丁酸钠抑制鼻咽癌细胞IDO表达的机制研究
近年来大量研究表明吲哚胺加双氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO)在肿瘤细胞逃避免疫监视、导致肿瘤发生过程中起着重要作用。临床研究证明IDO的抑制剂能增强化疗药的抗肿瘤作用。近来我们发现在鼻咽癌病理组织中高表达IDO，并证实了鼻咽癌细胞表达IDO是免疫逃避的机理之一。本研究通过系统的体外实验，探讨丁酸钠(NaB)是否能够抑制鼻咽癌细胞IDO的表达，并进一步探讨NaB抑制IDO表达的机制。
目的：
在IFN-γ诱导IDO表达的细胞信号传导通路上，分析NaB的作用位点，探讨CNE2细胞内NaB抑制IDO表达的机制，为其在鼻咽癌治疗中的应用提供实验依据。
方法：
1.通过免疫组化及免疫印迹检测人鼻咽癌细胞CNE2内IDO的表达，及NaB处理后CNE2细胞IDO的表达情况。
2.通过流式细胞仪检测NaB对CNE2细胞IFN-γ受体表达的影响。
3.利用免疫印迹检测NaB对Statl磷酸化影响。
4.通过转染CNE2细胞带有绿色荧光蛋白的Statl质粒，观察NaB对Statl的作用。
5.利用免疫沉淀的方法检测NaB是否乙酰化了CNE2细胞内的Statl。
6.利用Real-time PCR检测NaB对CNE2细胞内IRF-1转录的影响。
7.利用荧光素酶报告基因体系检测NaB对NF-kB转录活性的影响。
结果：
1.IFN-γ可诱导CNE2细胞高表达IDO。NaB抑制IFN-γ诱导的CNE2细胞内IDO的表达，并呈现出剂量、时间依赖性特征。
2.通过流式细胞仪检测了NaB作用下IFN-γR2的变化，结果显示在NaB的作用下，随着时间增加，IFN-γR2量增多，24h后从对照组3.3％增加到13.8％。证实了NaB并不是通过下调IFN-γ受体水平而抑制IDO表达的。
3.利用免疫印迹检测NaB对Statl磷酸化情况，IFN-γ作用下可明显激活Statl，经NaB处理24h后其在701位氨基酸的磷酸化完全受到抑制。
4.荧光示踪实验显示，IFN-γ处理4h后携有绿色荧光蛋白的Statl呈现细胞核转运趋势，加入NaB明显抑制IFN-γ诱导的Statl在核内集聚。推测NaB的作用阻止了Statl的细胞核转运。
5.免疫沉淀结果显示NaB处理12h后，Statl呈现高乙酰化趋势。
6.Real-Time PCR结果显示IFN-γ可明显增强IRF-1转录水平，经NaB处理后，IFN-γ诱导的IRF-1的转录水平显著降低。
7.报告基因检测结果证实，NaB可增强NF-kB的DNA的结合活性，推测NF-kB的活化并未直接介入到NaB抑制IDO表达的过程当中。
结论：
NaB作为一种潜在的抗肿瘤药，能够诱导肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞生长。在研究中我们首先证实了其可以完全抑制鼻咽癌细胞内IDO的表达，表明了其在鼻咽癌治疗中的价值。其次，分析了NaB抑制鼻咽癌细胞内IDO表达的机制，其机制可能是NaB乙酰化了调节IDO表达的细胞内转录因子Statl，抑制了Statl的磷酸化，同时减少了调节IDO表达的另一个细胞内转录因子IRF-1的表达，中断了IDO表达的细胞内信号传导通路，从而抑制IDO表达的。