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三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）主要产于中国、日本、朝鲜半岛及马来西亚群岛等海域，具有重要的经济价值和营养价值。本文将三疣梭子蟹作为研究对象，进行8周的养殖实验，评估饲料中不同脂肪水平对三疣梭子蟹幼蟹生长性能、血液生化指标、抗氧化能力、组织中脂肪酸组成、脂类代谢相关酶活和基因表达的影响。在此基础上，对三疣梭子蟹肠道微生物组成进行初步研究，评估饲料脂肪水平对三疣梭子蟹肠道微生物组成的影响，并对微生物功能进行预测。此外，本文对三疣梭子蟹长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）合成途径中的关键基因elovl4和elovl进行克隆，对fads2和elovl4的功能进行验证，初步研究三疣梭子蟹体内LC-PUFA的生物合成通路。本论文主要的研究内容及结果如下： 1.饲料中不同脂肪水平对三疣梭子蟹幼蟹生长、脂肪酸组成、抗氧化能力及脂类代谢相关基因表达的影响 为探究饲料不同脂肪水平对三疣梭子蟹幼蟹生长性能、血液生化指标、抗氧化能力、组织中脂肪酸组成，脂类代谢相关酶活和基因表达的影响，选取240只初始体重为21.09±1.11g的三疣梭子蟹幼蟹，随机分为3个处理组，每个处理组设置4个重复，每个重复20只蟹，在单体筐中进行养殖实验，养殖周期为8周。本实验以鱼油和大豆卵磷脂为脂肪源，配制成脂肪含量分别为5.83%、9.91%和15.07%的3种等氮饲料（粗蛋白质47%）。实验结果显示：在15.07%组的三疣梭子蟹生长性能、饲料利用率和存活率均显著低于5.83%组和9.91%组（P＜0.05）。随着饲料中脂肪含量的增加，肝胰腺和肌肉中粗脂肪含量显著升高（P＜0.05）。肝胰腺和肌肉中脂肪酸组成反映了饲料脂肪酸组成。15.07%组的三疣梭子蟹血清和肝胰腺中丙二醛（MDA）含量均显著高于其它组（P＜0.05）；肝胰腺超氧化物歧化酶（T-SOD）和血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力最高值均在5.83%组中（P＜0.05）。在15.07%组中，肝胰腺中脂肪酸合成酶（FAS）和葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PD）的酶活性最低，而肉毒碱棕榈酰转移酶1（CPT1）的酶活性显著高于其他处理组（P＜0.05）。随着饲料脂肪含量的增加，脂肪酸去饱和酶2（fads2）、脂肪酸碳链延长酶4（elovl4）、脂肪酸碳链延长酶（elovl）、低密度脂蛋白受体相关蛋白2（lrp2）、脂蛋白受体1（lpr1）、B族清道夫受体（srb）、脂肪酸结合蛋白3（fabp3）、脂肪酸结合蛋白9（fabp9）、脂肪酸转运蛋白4（fatp4）、肉毒碱棕榈酰转移酶2（cpt2）、乙酰辅酶a氧化酶1（acox1）、乙酰辅酶a氧化酶2（acox2）、乙酰辅酶a氧化酶3（acox3）、fas、乙酰辅酶a羧化酶（acc）、g6pd、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6pgd）、二脂酰甘油酰基转移酶1（dgat1）、甘油-3-磷酸乙酰转移酶1（gpat1）、甘油-3-磷酸乙酰转移酶3（gpat3）、激素敏感性脂肪酶（hsl）、胞内脂肪酶（il）、甘油三酯脂酶（tgl）、胰脂酶（pl）、固醇调控元件结合蛋白-1（srebp-1）、肝核因子4α（hnf4ɑ）和类视黄醇X受体（rxr）基因表达均显著降低（P＜0.05），然而载脂蛋白D（apod）和cpt1基因表达却显著升高（P＜0.05）。当饲料中脂肪含量从5.83%提高到9.91%时，肝胰腺中脂肪酸结合蛋白1（fabp1）的基因表达显著升高，而后随着脂肪水平升高，fabp1的基因表达显著下降（P＜0.05）。本研究表明，高脂饲料会抑制三疣梭子蟹生长，降低饲料利用率和抗氧化性能。高脂饲料可显著抑制三疣梭子蟹幼蟹脂类代谢（合成代谢和分解代谢）相关酶活力和基因表达水平。 2.饲料中不同脂肪水平对三疣梭子蟹幼蟹肠道微生物组成的影响 为探究饲料不同脂肪水平对三疣梭子蟹幼蟹肠道微生物组成的影响。选取180只初始体重为21.09±1.11g的三疣梭子蟹幼蟹，随机分为3个处理组，每个处理组设置3个重复，每个重复20只蟹，在单体筐中进行养殖实验，养殖周期为8周。本实验以鱼油为脂肪源，配制成脂肪含量分别为5.83%、9.91%和15.07%的3种等氮饲料（粗蛋白质47%）。基于IlluminaHiSeq-PE250测序平台，进行16SrRNA基因分析，检测三疣梭子蟹肠道内微生物群落的结构及变化情况。实验结果显示，三疣梭子蟹肠道细菌主要由变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）和软壁菌门（Tenericutes）的细菌组成。随着饲料中脂肪含量的升高，三疣梭子蟹肠道中梭杆菌门细菌的相对丰度显著降低（P＜0.05），而变形菌门的相对丰度显著升高（P＜0.05）。且弧菌科（Vibrionaceae）和纤毛菌科（Leptotrichiaceae）细菌的相对丰度受脂肪水平的影响显著（P＜0.05）。9.9%脂肪组和15.1%脂肪组的三疣梭子蟹肠道病原菌的相对丰度显著高于5.8%脂肪组（P＜0.05）。PCoA图和UPGMA聚类分析均显示，脂肪是细菌群落组成的重要决定因素，并且9.91%脂肪组和15.07%脂肪组的三疣梭子蟹肠道微生物群落组成较5.83%脂肪组更相似。上述研究表明，饲料中的脂肪水平可显著影响三疣梭子蟹肠道菌群组成，高脂饲料可能会增加三疣梭子蟹感染疾病的风险，进而危害其健康。 3.三疣梭子蟹脂肪酸延长酶4（elovl4）和脂肪酸延长酶（elovl）基因的分子克隆和序列分析 脂肪酸延长酶（elovl）是参与长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）生物合成的关键酶。Elovl4的研究对了解三疣梭子蟹LC-PUFA以及超长链多不饱和脂肪酸（VLC-PUFA）的合成至关重要。本研究利用RACE技术，从三疣梭子蟹的肝胰腺中克隆出elovl4和elovl的cDNA序列。获得elovl4和elovl开放阅读框（ORFs），分别含有1038bp和1077bp，分别编码346和359个氨基酸。elovl4和elovl都具有典型的延长酶结构，分别具有6个和7个跨膜结构域，具有组氨酸盒结构（HXXHH），其氨基酸序列具有高度保守性，但缺乏内质网滞留信号。系统发育树结果显示三疣梭子蟹与拟穴青蟹（Scylla paramamosain）和日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）的进化关系较中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）近。三疣梭子蟹elovl4和elovl mRNA在各组织中均有表达，但其表达水平显著不同，elovl4主要在肠道和肝胰腺中表达量最高，其次是眼柄和胃（P＜0.01）；而elovl主要在肝胰腺和胃中表达，其次是脑神经节（P＜0.01）。 4.三疣梭子蟹LC-PUFA合成通路的研究—fads2及elovl4的功能验证 为探究三疣梭子蟹LC-PUFA生物合成途径，在本研究中，从三疣梭子蟹肝胰腺中获得fads2和elovl4的ORF，采用酿酒酵母细胞对fads2和elovl4进行了功能性验证。功能研究的结果显示，三疣梭子蟹fads2具有△6和△8去饱和酶活性，能够催化18∶2n-6和20∶2n-6去饱和生成18∶3n-6和20∶3n-6。三疣梭子蟹elovl4编码的蛋白在功能上与elovl5的功能有相重的活性，而且，elovl4能够通过“Sprecher途径”来合成DHA的上游脂肪酸。对fads2和elovl4的功能分析发现这两个基因均参与了LC-PUFA的生物合成途径。