【摘 要】
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骨关节炎是最常见的关节疾病,常好发于中老年的动物,也是中老年动物体致残的主要原因。骨关节炎严重影响着患病机体的生活质量,这对畜牧行业和宠物行业的发展也产生很大影响。有学者观察到,临床上II型糖尿病和骨关节炎通常并发,并且与非糖尿病并发的骨关节炎病患相比症状通常较为明显。为此,本实验将探究骨关节炎合并糖尿病之后,软骨组织及细胞的降解、损伤和衰老程度的变化,同时,在体外以不同葡萄糖浓度培养软骨细胞,探
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骨关节炎是最常见的关节疾病,常好发于中老年的动物,也是中老年动物体致残的主要原因。骨关节炎严重影响着患病机体的生活质量,这对畜牧行业和宠物行业的发展也产生很大影响。有学者观察到,临床上II型糖尿病和骨关节炎通常并发,并且与非糖尿病并发的骨关节炎病患相比症状通常较为明显。为此,本实验将探究骨关节炎合并糖尿病之后,软骨组织及细胞的降解、损伤和衰老程度的变化,同时,在体外以不同葡萄糖浓度培养软骨细胞,探究高浓度葡萄糖环境对软骨细胞的影响,从而为今后衰老机制的深入研究提供实验参考。体内实验,通过使用注射链脲佐菌素(STZ)联合饲喂高能量饲料的造模方法,建立老年II型糖尿病大鼠模型。通过观察各组大鼠的体态及行为,检测各组大鼠血清中IL-6和IL-8的含量,对大鼠的股骨远端关节面进行观察及Mankin评分,对膝关节组织进行HE染色、番红O固绿染色以观察软骨层的病理变化,应用茜素红S染色以观察软骨层的钙化情况,使用免疫组织化学染色的方法检测软骨组织中II型胶原、MMP-13和p21的蛋白表达情况,进而评估实验组大鼠软骨组织代谢及衰老相关指标的变化。体外实验,取17日龄的SD大鼠膝关节软骨细胞进行体外培养和传代,使用第1代和第5代软骨细胞,首先对各组细胞进行形态学观察,甲苯胺蓝染色和免疫荧光检测从而对所培养的软骨细胞进行鉴定,然后将1代和5代细胞分别划分为3组,为1代低糖组、1代中糖组、1代高糖组、5代低糖组、5代中糖组和5代高糖组,从原代开始就分别用3种含有不同浓度的葡萄糖的细胞培养基进行培养。通过使用免疫荧光的方法检测各组细胞II型胶原的表达情况,茜素红S染色对比各组细胞的钙化情况,以及使用Western Blotting方法观察各组细胞II型胶原、MMP-13、p21、p53、p16的蛋白表达水平,检测各组细胞产生ROS的水平,进而评估不同浓度的葡萄糖培养环境对软骨细胞的影响。结果显示,实验组大鼠的糖尿病模型建立成功,与对照组相比,眼观实验组大鼠的关节软骨,表面软骨层变薄,色泽暗淡;切片的HE和番红O固绿染色结果显示,实验组软骨全层明显变薄,表层出现裂隙增多,纤维化明显,软骨细胞数量减少并且排列混乱,Mankin评分升高;茜素红S染色结果显示钙化层的钙化程度增加;血清中IL-6和IL-8的含量明显上升;免疫组化结果显示实验组软骨层II型胶原的含量大幅减少,MMP-13和p21的含量明显上升。体外培养软骨细胞的结果显示,随着传代次数的增加以及高浓度葡萄糖的处理,5代高糖组细胞的茜素红S的染色强度最强,ROS的产生也最多,免疫荧光的结果显示其II型胶原的染色强度最弱,Western Blotting检测结果中II型胶原的蛋白表达水平也是最低的,MMP-13的表达则为最高,6组细胞衰老相关蛋白p21、p53、p16的表达呈逐渐上升的趋势。实验结果表明,患有糖尿病的老年大鼠的关节软骨组织的软骨退化和软骨损伤更为严重,软骨层更薄,软骨组织的衰老程度也加重;通过使用高浓度葡萄糖培养软骨细胞,会加重软骨细胞的氧化应激水平,加速其基质的降解,也使软骨细胞的衰老程度增加,并且总的来看5代细胞的变化要较1代细胞更加明显。
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