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研究背景:目前,牙髓炎及牙髓坏死的发病率呈现出逐年增高的趋势。临床对于治疗严重牙髓病变的主要方式——根尖诱导成形术和根管治疗——并不能完全恢复牙齿的功能。随着近年来干细胞与组织工程技术的发展,牙髓再生成为解决严重牙髓病变的新型治疗方法。同时人乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)及细胞聚合体技术的应用很大程度上提高了牙髓再生的效率。在前期实验中,SHED聚合体分别被应用于小型猪年轻恒牙牙髓再生的动物实验,以及人年轻恒牙和根尖已闭合的恒牙牙髓再生的临床实验中。但是只在小型猪和人的年轻恒牙中取得了良好的牙髓再生效果,根尖已闭合的恒牙并未取得良好的疗效。这极有可能与根尖已闭合的恒牙根尖孔狭窄血供不足无法供给足够的营养用于组织再生有关。外泌体(Exosomes)是由细胞分泌并可以被周围细胞摄取利用的微小囊泡,其不仅可以运输蛋白,特异性靶定受体细胞,交换蛋白和脂类以及引发下游信号通路;同时也可以运输包括微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)在内的多种核酸,对血管、神经等组织器官再生均具有促进作用。研究表明,牙髓干细胞单细胞来源的Exosomes对细胞牙源性分化所需基因的表达以及牙髓再生均具有促进作用。研究表明,不同细胞分泌的Exosomes以及同一细胞在不同状态下分泌的Exosomes均存在差异,那么细胞处于聚合体状态下和处于单细胞状态下所分泌的Exosomes是否存在差异;如果存在差异,此差异是否是造成聚合体牙髓再生效果优于单细胞的原因之一尚未见报道。研究目的:本课题拟通过比较聚合体及单细胞来源Exosomes的差异,以从Exosomes角度探究聚合体牙髓再生效果优于单细胞的原理及机制,进而寻找根尖已闭合恒牙牙髓再生的临床治疗方法,同时也为其他组织再生研究提供新的思路。研究方法:1.SHED的分离、培养和鉴定:本实验使用胶原酶消化法以及差异贴壁法分离并纯化SHED;采用流式细胞术鉴定间充质干细胞表面标志物;甲苯胺蓝染色检测细胞集落形成能力;甲基噻唑基四唑检测细胞生长曲线;成骨、成脂诱导检测细胞多向分化潜能。2.Exosomes提取鉴定及miRNA数据采集信息分析:通过超速离心法提取Exosomes,通过透射电镜观察Exosomes形态和大小、粒径检测分析Exosomes直径大小、流式细胞术检测Exosomes表面标志物对Exosomes进行鉴定;利用BGISEQ-500测序技术对Exosomes所含miRNA进行测序,将数据与第22版的miRBase数据库进行比对。3.不同来源Exosomes对SHED生物活性及成血管神经能力影响的比较:利用细胞增殖检测试剂盒及流式细胞术检测Exosomes对SHED增殖和凋亡的影响;通过成骨成脂诱导实验检测Exosomes对SHED多向分化潜能的影响;通过实时定量聚合酶链反应检测Exosomes对SHED分泌血管、神经营养因子能力的影响。4.裸鼠背部皮下异位移植牙髓再生体内实验:临床收集患者脱落恒切牙,制备全长牙根;抑制Exosomes SHED聚合体、SHED聚合体、促进Exosomes SHED聚合体分别与全长牙根复合后植于裸鼠背部皮下;3个月后处死裸鼠,取出聚合体牙根复合体并脱钙切片染色,通过苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosin stain,HE)观察再生牙髓组织结构、通过牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)免疫组化染色观察成牙本质细胞层(odontoblast layer,OL)再生情况、通过CD31免疫荧光染色观察血管再生情况、通过S100免疫荧光染色观察神经再生情况。5.小型猪恒牙牙髓腔原位移植牙髓再生临床前实验:拔除小型猪原有牙髓,将抑制Exosomes SHED聚合体、SHED聚合体、促进Exosomes SHED聚合体植入小型猪牙髓腔中;6个月后处死小型猪,拔除牙齿,通过微计算机断层扫描技术扫描牙齿并对牙齿进行三维重建;通过HE染色观察再生牙髓组织结构、通过DSPP免疫组化染色观察OL再生情况、通过CD31免疫荧光染色观察血管再生情况、通过S100免疫荧光染色观察神经再生情况。研究结果:1.分离纯化后的SHED呈长梭形;间充质干细胞表面标志物呈阳性、而造血干细胞细胞表面标志物呈阴性;细胞具有良好的自我更新能力和多向分化潜能。2.SHED单细胞及SHED聚合体来源Exosomes均呈茶托样或凹半球样,直径均在100 nm左右;单细胞来源Exosomes颗粒主峰小于聚合体来源Exosomes,但二者平均粒径较一致;Exosomes表面标志物均呈阳性;聚合体来源Exosomes中抑制细胞凋亡和促进血管、神经修复再生的miRNA表达量高于单细胞来源Exosomes。3.Exosomes对于SHED增殖无影响,但可以抑制SHED凋亡;并可以促进SHED多向分化及分泌血管、神经营养因子,且聚合体来源Exosomes效果优于单细胞来源Exosomes。4.Exosomes可以促进异位移植形成的牙髓组织中的SHED向成牙本质细胞、血管内皮细胞和神经细胞分化,且聚合体来源Exosomes效果优于单细胞来源Exosomes。抑制Exosomes会造成再生牙髓组织出现坏死。5.小型猪牙髓腔内原位移植入人SHED聚合体未出现排异反应。Exosomes可以促进原位再生牙髓组织结构形成、OL再生、血管再生和神经再生,且聚合体来源Exosomes效果优于单细胞来源Exosomes。再生血管与神经相伴行;聚合体来源Exosomes可以促进再生主血管两侧再生出形态连续的神经组织。抑制Exosomes则会造成再生牙髓组织出现钙化。结论:1.聚合体来源Exosomes中大直径颗粒较单细胞来源Exosomes多;聚合体来源Exosomes中抑制细胞凋亡和促进血管、神经修复再生的miRNA表达量高于单细胞来源 Exosomes。2.Exosomes可以抑制SHED凋亡并促进SHED多向分化及分泌血管、神经营养因子,且聚合体来源Exosomes效果优于单细胞来源Exosomes。3.Exosomes可以促进小型猪牙髓腔原位移植和裸鼠背部皮下异位移植牙髓组织再生,且聚合体来源Exosomes效果优于单细胞来源Exosomes。聚合体来源Exosomes可以显著促进血管、神经再生。SHED聚合体联合SHED聚合体来源Exosomes可被用于根尖已闭合恒牙牙髓再生的临床治疗。