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目的：丹参的水溶性物质-丹参酚酸B(SA-B)对TGF-β1活化的肝星状细胞内Smad和ERK、p38 MAPK信号传导通路有抑制作用。但是SA-B是否通过Smad抑制HSC活化的ERK、p38 MAPK信号传导通路还需要深入研究。
方法：一部分采用原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心的方法分离正常大鼠HSC,然后同样运用p38(SB203580)和ERK(PD98059)通路的特异性阻断剂分别阻断HSC内p38 MAPK和ERK信号通路,用Western blot法测定细胞中磷酸化MEK、p38、MKK3/6蛋白和a-SMA、I型胶原蛋白的表达；另一部分利用RNAi的技术阻断TGF-β1刺激人HSC细胞株LX-2引起的Smad信号通路,然后运用p38和ERK通路的特异性阻断剂分别阻断HSC内p38 MAPK和ERK信号通路,用Western blot法测定细胞中磷酸化MEK、p38、MKK3/6蛋白和α-SMA、I型胶原蛋白的表达。
结果：
(1)成功构建了Pol II miR RNAi载体,经过筛选后Smad4干扰效率达到70.3％(P<0.01)。
(2)TGF-β1刺激大鼠原代HSC和LX-2的ERK信号通路对p38 MAPK通路上的p38、MKK3/6蛋白激酶的磷酸化似乎没有影响；同样,TGF-β1刺激原代和LX-2的p38 MAPK通路对ERK通路上MEK蛋白激酶的磷酸化似乎也没有影响。
(3)TGF-β1刺激LX-2的Smad信号通路可促进ERK通路中MEK蛋白激酶的磷酸化(P<0.01),而对p38 MAPK通路上p38、MKK3/6蛋白激酶的磷酸化似乎没有影响。
(4)SA-B对大鼠原代HSC和LX-2细胞株内TGF-β1的ERK信号通路上MEK蛋白激酶的磷酸化和p38 MAPK信号通路上p38、MKK3/6蛋白激酶的磷酸化有直接的抑制作用(P<0.01和P<0.001);SA-B虽可能通过抑制TGF-β1刺激LX-2的Smad通路间接抑制ERK通路上MEK蛋白激酶的磷酸化,但是其直接抑制MEK蛋白磷酸化的作用也是明显的(P<0.001)。
(5)阻断HSC内的ERK通路和(或)p38 MAPK通路,细胞内α-SMA的表达明显降低(P<0.01)。在正常培养的HSC,阻断ERK通路,α-SMA的表达下降更为显著(P<0.01);而在经TGF-β1刺激的HSC,阻断p38 MAPK通路后,α-SMA的表达下降更为显著(P<0.001)。阻断ERK通路和p38 MAPK通路后,HSC内I胶原蛋白合成均下降,阻断ERK通路对降低TGF-β1刺激HSC中I胶原蛋白合成的作用更为显著(P<0.01)。
(6)SA-B可能主要通过抑制p38 MAPK通路的转导,抑制TGF-β1激发的α-SMA的表达；SA-B可能主要通过抑制ERK通路的转导,抑制TGF-β1激发的I型胶原蛋白的表达。
结论：
(1)应用RNA干扰技术,成功构建了Smad4 Pol II miR RNAi载体,有效干扰Smad4的表达。
(2)发现HSC内TGF-β1的Smad信号通路对p38通路不存在“串话”,而对ERK通路存在“串话”；ERK通路和p38通路之间无明显的“串话”现象。
(3)SA-B分别直接抑制TGF-β1在HSC内ERK通路和p38通路的信号传导；其作用环节分别是抑制MEK激酶和MKK3/6激酶的磷酸化。
(4)特异性抑制TGF-β1的信号传导,是SA-B“化”肝纤维化之“瘀”的关键。