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岗梅为冬青科(Aquifoliaceae)植物梅叶冬青Ilex asprella(Hook.et Arn.)Champ.ex Benth.的根，是岭南地区常用的清热解毒中药材之一。其主要含熊果烷型的三萜皂苷，一类由α-香树酯醇（α-amyrin）衍生而来的五环三萜类化合物。岗梅熊果烷型三萜皂苷拥有广泛的生理活性，具有较高的药用价值，然而不论是利用植物化学分离还是通过化全合成均较难以大量获取，限制了人们对这类成分的开发利用。近年来新兴的合成生物学为大量获取该类化学成分提供了一种潜在的有力手段，即通过解析目标化合物的关键酶基因，将这些外源基因引入微生物等宿主细胞中进行异源代谢，有望能快速大量地获取该类化合物。岗梅三萜皂苷母核α-amyrin形成的关键酶基因（IaAS1）已经鉴定，但合成途径下游与母核修饰相关的多个CYPs氧化酶和UGTs糖基转移酶尚不明确，有待于深入研究。 目的: 通过对转录组数据的深度挖掘，筛选岗梅中与三萜皂苷生物合成相关下游途径关键修饰酶（氧化酶CYPs和糖基转移酶UGTs），并加以功能验证，获得三萜皂苷生物合成关键元件，为阐明岗梅三萜皂苷生物合成途径和构建合成三萜皂苷的酵母细胞工厂奠定基础。 方法: 1.候选CYPs和UGTs基因的筛选与克隆 利用外源激素（茉莉酸甲酯）喷施岗梅地上部分，，取样进行转录组测序。将获得的岗梅叶与前期获得的转录组根数据合并，重新组装，分析诱导后CYPs、UGTs的差异表达基因，并利用已鉴定的与三萜皂苷生源途径相关的CYPs和UGTs基因与岗梅转录组中的CYPs和UGTs基因进行系统进化树分析，结合序列同源比对的方式筛选得到候选基因。根据候选基因序列，设计引物，以岗梅cDNA为模板扩增候选基因的功能区域（开放阅读框），进一步构建相应的克隆载体。对克隆得到的基因进行Sanger测序，利用生物软件分析并预测候选基因编码蛋白的理化性质，包括蛋白质的功能及其一级结构、二级结构和三级结构。 2.CYPs基因的真核表达和功能分析 构建CYPs基因的酵母表达载体，转化至高产α-amyrin的酿酒酵母WAT11tfAX菌株(本课题组构建，unpublished data)中，进行目的基因编码蛋白的酵母异源表达。利用Western blot技术检测目的蛋白质的表达，提取酵母代谢物，经衍生化后，运用GC-MS检测代谢产物，确认目的基因的功能。同时，构建带EGFP荧光标签的植物表达载体，将目的基因转化至烟草原生质体中，观测该基因的亚细胞定位。 3.UGTs基因的原核表达和功能分析 利用pET32a(+)E.coli原核表达体系，在E.coli Rossetta中表达UGTs，通过镍纯化柱后;分别以6种不同的三萜皂苷元和UDP-葡萄糖为底物，进行体外酶促反应。采用葡聚糖凝胶柱对酶促反应的产物进行分离纯化，然后采用MS和NMR对该产物进行结构鉴定，确定UGTs功能。通过蛋白质同源模拟和分子对接预测UGTs的关键活性位点，分析UGT可能的催化机制。类似的，利用EGFP荧光标签，检测其亚细胞定位。 4.外源三萜皂苷生物合成途径引入酿酒酵母 将岗梅三萜环化酶基因IaAS1与本研究中已鉴定功能的CYP和UGT，通过游离质粒导入S.cerevisiae WAT11tfAX中进行组合表达。同时，利用CRISPR/Cas9基因编辑法，将3个基因整合至WAT11tfAX基因组中，构建稳定菌株。利用LC/MS分析两种菌株的代谢产物。 5.岗梅基因组survey分析 提取岗梅基因组DNA，构建测序文库，用Illumina HiSeq平台测序，将测序得到的数据进行质量评估，拼接组装，用17-mer分析预测基因组大小、杂合度和重复率复杂程度。 结果: 1.获得比前期课题组更高质量的转录组数据，获得更多注释信息，茉莉酸甲酯诱导后岗梅转录组差异表达的基因未能找到与三萜皂苷相关的CYPs和UGTs基因，通过对转录组的深度挖掘分析筛选并克隆得到3个CYPs和5个UGTs的候选基因，并对其蛋白序列进行一级、二级、三级结构进行分析，为后续酶功能鉴定提供材料和理论参考。 2.岗梅IaCYP3010编码1个三萜皂苷C-28氧化酶基因。构建带HIS特异性标签的3个CYPs基因（IaCYP3010、IaCYP21058和IaCYP3769）的真核表达载体3个CYPs基因均能在S.cerevisiae WAT11tfAX)中成功表达。代谢产物的GC/MS检测结果表明，IaCYP3010为香树脂醇的C-28位氧化酶，催化α-amyrin生产熊果酸。该蛋白IaCYP3010定位为叶绿体。 3.IaUGT317编码1个三萜皂苷C-28糖基转移酶。克隆并成功表达5个UGTs。酶促反应结果显示，IaUGT317能够催化熊果酸、冬青素A、常春藤皂苷元生成新的化合物。扩大以熊果酸为底物的酶反应体系，将产物进行分离纯化之后进行QTOF和NMR分析，确定产物为28-O-β-D-吡喃葡萄糖熊果酸酯，确证IaUGT317的糖基化催化位点为C-28。亚细胞定位实验结果显示，该蛋白定位于细胞质。 4.成功在酿酒酵母中构建岗梅三萜生物合成途径。分别用游离质粒转化法和基因编辑法将OSC基因IaOSC1、C-28位氧化酶基因IaCYP3010和C-28位糖基转移酶基因IaUGT317引入S.cerevisiae WAT11tfAX）中，成功鉴定到目标产物28-O-β-D-吡喃葡萄糖熊果酸酯。 6.获得岗梅基因组测序数据23.5Gb，测序深度为29.72×;通过17-mer分析预估的基因组大小为790.3Mb，杂合度为1.06％，重复序列比例为52.39％;由各项分析可以得出岗梅的基因组为高复杂基因组。 结论: 本研究成功鉴定了岗梅三萜皂苷生物合成下游途径中1个CYP氧化酶基因和1个UGT糖基转移酶基因，并成功将合成熊果烷型三萜皂苷的外源途径导入S.cerevisiae中，获得了熊果酸和28-O-β-D-吡喃葡萄糖熊果酸酯。研究结果为后续进一步发掘岗梅生物合成相关CYPs和UGTs，以及开展岗梅三萜皂苷的合成生物学研究奠定了重要基础。