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我国是世界第一养猪大国和猪肉消费大国,拥有很多世界闻名的地方品种,但和畜牧业发达国家相比,我国猪的育种水平处于落后状态。上世纪80年代以来人们开始深入研究猪重要经济性状的分子遗传基础,寻找与猪重要经济性状相关的候选基因、QTL和遗传标记。发现这些QTL、基因或标记,对于应用标记辅助选择和标记辅助导入育种改进猪的遗传进展有很大意义。
黄志宏(2005)采用cDNA池直接测序的方法从长白×蓝塘家系F<,2>群体中共筛选到21个SNPs。其中编号为E53的EST在309bp处A→G单核苷酸多态对背膘厚影响显著(P<0.05),编号为E87的EST在532bp处A→G单核苷酸多态对达100kg体重日龄影响显著(P<0.05)。本研究通过PCR-RFLP的方法,验证E53和E87两个SNP的多态性在F<,2>群体外的其它猪群对背膘厚和达100公斤体重日龄的影响是否和黄志宏(2005)结果一致:采用RACE和BAC文库筛选的方法获取:E53和E87所在基因的序列,预测在猪中E53和E87基因名称,并通过实时定量PCR方法比较在蓝塘猪、长白猪两品种中E53和E87所在基因表达差异,分别采集了蓝塘与长白猪出生、断奶、30kg、60kg和90kg体重5个不同生长期的眼肌组织,分析同一品种内不同时期、及不同品种同一时期两基因转录水平表达差异。本研究的主要结论如下:
1、在广东省中山市某种猪场采集226头样品,对E53和E87进行PCR-RFLP多态性检测,并与性状进行关联分析。结果表明:E53在B、C两点(bib、bfc)背膘厚及平均背膘厚(bfav)上,各基因型背膘厚度都依次为TT>TC>CC,在B点背膘厚(bib)和平均背膘厚(bfav)上,CC和TC基因型间差异极显著(P<0.01),CC和TT基因型间差异显著(P<0.05),TC与TT间差异不显著。在C点背膘厚(bfc),CC和TT基因型间差异极显著(P<0.01),TC与CC和TT基因型间差异均显著(P<0.05)。E53在B、C两点(bib、bfc)活体背膘厚及活体平均背膘厚(bfav)上都是TT基因型背膘最厚,与黄志宏(2005)在长白×蓝塘家系F<,2>群体获得的结果一致,进一步验证了黄志宏(2005)结果的可靠性。
E87各基因型对达100公斤体重日龄(day100)影响都不显著,E87各基因型间达100公斤体重日龄依次为AA≈AG>GG,与黄志宏(2005)F<,2>群体中分析的结果矛盾。
2、E53 3’RACE得到457bp包含PolyT的片段,E53 3’端已经达到了末端,BAC文库测序首次获得E53所在基因的1885bp序列,E53所在基因为猪糖原脱支酶基因(GDE)。目前尚未见猪糖原脱支酶基因序列报道;糖原脱支酶基因与体内糖原的降解有关,糖原在体内的沉积和降解与脂肪的代谢有着紧密的联系,间接影响体内脂肪沉积。推断E53所在基因(即糖原脱支酶基因)A→G SNP多态性可作为猪活体背膘厚的分子候选标记。
3、E87 5’RACE在已知序列基础上成功延伸了5’端268bp序列;通过BAC文库测序首次获得了E87所在基因的2730bp序列,通过Blast比对分析,证实E87所在基因为猪的CRYAB基因;GENSCAN预测猪CRYAB基因有3个外显子,编码105个氨基酸;通过序列进化树结构分析表明:猪与牛的CRYAB基因首先聚为一类、人与黑猩猩聚为一类,小鼠与大鼠聚为一类。
4、实时定量PCR结果表明,GDE和CRYAB在长白和蓝塘猪品种间存在差异表达,蓝塘猪两个基因的表达量都普遍比长白猪高。品种内不同时期两基因也存在差异表达。蓝塘猪断奶时GDE的表达量比其他四个时期高,长白猪在30kg体重时GDE表达量比其他四个时期高。CRYAB在蓝塘猪中除了断奶期外,从初生到90kg表达量有上升的趋势;CRYAB在长白猪60kg与其它各时期比表达量上调。
5、组织表达谱分析表明:E53和E87在猪心、肝、脾、肺、肾、胃、膀胱、背最长肌、腹脂、大脑、小脑、下丘脑、大肠、小肠、背膘、胰脏共16组织都有表达。