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香蕉(Musa acuminata)是世界上重要的粮食作物之一。香蕉属于热带作物,最适种植温度条件为24℃~35℃,在热带和亚热带气候地区广泛种植。由于全球气候的变化,香蕉遭受许多非生物胁迫,如高温胁迫,当温度高于35℃时,香蕉的生长和发育受到严重影响。内生根真菌印度梨形孢(Piriformospora indica,P.indica)与丛枝菌根真菌(Abuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)相似,可提高植物对矿质元素的吸收能力,促进植物的生长和发育,能增强其对生物和非生物胁迫的耐受性。然而,关于香蕉接种内生真菌后高温胁迫响应的叶片生理生化和分子机制知之甚少。本研究以福建地区主栽品种“天宝”香蕉为材料,研究接种内生菌P.indica后香蕉热胁迫下的生理生化变化、转录组分析和小RNA差异表达分析,以探讨P.indica提高香蕉耐热性的生理生化及分子机制,以期为进一步利用有益内生菌P.indica,以高温综合管理和化学防治的形式寻觅一种既有助于植物生长发育又能抵御高温胁迫的可行性方法提供科学依据。本研究首先测定和比较了45℃高温处理下0 h、3 h、6 h、12 h,24 h和3 d的有/无P.indica定殖的‘天宝’香蕉叶片中抗氧化活性物质水平及激素含量变化情况;然后,使用BGISEQ-500测序平台对常温(28℃)和高温胁迫(45℃、3 d)下对香蕉叶片进行转录组和小RNA测序分析,拟探索香蕉高温胁迫的响应途径和耐热机制,以期为香蕉耐高温基因的挖掘和耐高温品种的选育提供科学依据。主要研究结果如下:1.高温胁迫下有/无定殖P.indica的‘天宝’香蕉叶片生理生化水平变化涉及植物高度,叶片数,叶面积大小和假茎周长的评估显示,在两种条件下均受P.indica的影响。研究结果表明,在P.indica处理下,香蕉的生长和发育显着提高。香蕉的叶数、叶面积大小、假茎周长和株高均显著高于非定殖香蕉。测定和比较了高温处理后有/无P.indica定殖的香蕉叶片(各3个重复)抗氧化活性物质水平及激素含量变化。结果表明:过氧化氢(H2O2)含量呈先升后降的变化趋势,脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量呈下降趋势,同时,P.indica定殖的香蕉叶片中H2O2、Pro和MDA含量均高于无定殖对照;高温处理3 d后,定殖P.indica叶片中Pro和H2O2含量均显著低于未定殖的植株叶片,且定殖P.indica的叶片中MDA含量与未定殖叶片水平相当。高温处理下,香蕉叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性均逐步升高,且在P.indica定殖的香蕉叶片中以上指标均低于无定殖组。P.indica定殖的香蕉在高温处理各时间点变化不显著,而无定殖组多酚氧化酶(PPO)活性在高温处理3 h时显著升高。激素水平上,高温处理前后P.indica定殖植株叶片中生长素吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)含量均低于无定殖组,ABA含量显著高于无定殖组,茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)含量差异不大;高温处理3 d后,JA、GA和IAA含量较未定殖增加,而ABA和SA的变化规律相反,定殖组SA含量低于非定殖组。研究结果表明P.indica可以通过提高香蕉叶片中H2O2、Pro、MDA和ABA含量,抑制IAA和GA含量使得香蕉具有更高的耐热能力。2.高温胁迫处理的香蕉叶片转录组分析基于转录组学研究,挖掘与P.indica对香蕉生长和耐高温有关的基因及转录因子调控网络。提取在28℃(CK)、45℃条件下培养的“天宝”蕉叶片总RNA(各3个重复),构建c DNA文库,采用BGISEQ-500测序平台进行转录组测序分析。结果显示,从每个样品组装的转录本的平均长度在90~100bp之间,组装的转录本序列长度在252~2912 nt之间,每个文库的Q20和Q30分别高于97%和88%,不确定碱基比率为0.12%,0.13%,0.15%和0.16%;GC含量超过47%。在六个比较组之间的分析结果显示有24,019个差异表达基因(DEGs)。在C28-vs-P28比较组中有4,386个DEGs,其中1,877个上调表达,2,509个下调表达;在C45-vs-P45比较组中有802个DEGs,其中上调表达653个,下调表达149个;在C28-vs-C45比较组中有19,996个DEGs,其中7,560个上调表达,12,436个下调表达;在P28-vs-P45比较组中有21,027个DEGs,其中8,715个上调表达和12,312个下调表达;在C28-vs-P45比较组中有20,472个DEGs,上调表达8,402个,12,070个下调表达;在P28-vs-C45比较组中有20,157个DEGs,其中7,534个上调表达,12,628个下调表达。GO富集的DEGs发现:高温胁迫下香蕉叶片的光合系统、细胞和膜系统受到显著影响。KEGG数据库结果显示:富含代谢途径的差异基因数量最多。与未定殖的幼苗相比,高温处理下显著富集的途径包括次生代谢产物、生物合成、光合作用、糖胺聚糖降解、代谢途径、乙醛酸、二羧酸,富集途径包括植物激素信号传导、MAPK信号传导、植物-病原体相互作用、苯丙烷类生物合成、光合作用、花色苷生物合成、淀粉和蔗糖生物合成、脂质代谢、光合作用-天线蛋白和单萜类生物合成(Photosynthesisantenna protein)等。q RT-PCR结果表明:测序结果准确性较高,HSFs和HSPs基因在P.indica影响下的香蕉响应高温胁迫过程中起重要作用。3.高温胁迫下香蕉叶片小RNA分析使用BGISEQ-500测序平台对用于转录组测序的同一样品进行小RNA测序。测序结果表明:共有185个已知mi RNA、93个novel mi RNA和5,039个si RNA可响应P.indica和高温胁迫。该差异表达显示对差异表达的mi RNA的分析表明:某些mi RNA家族在高温胁迫下在P.indica影响下有特异性反应,并且同一家族的不同成员在P.indica定殖和高温胁迫不同处理组下具有不同的表达模式。例如:novel_mir85、novel_mir11、novel_mir71、novel_mir35、mi R156、mi R171、mi R172a、mi R164e-5p和mi R396b以上mi RNA可能在香蕉响应高温胁迫过程中发挥重要作用。差异表达si RNAs分析显示:si RNAs在香蕉响应高温胁迫过程中扮演重要角色。例如,在预测到的si RNAs中,随处理温度的升高,预测到的si RNAs种类及数量逐渐增多。GO和KEGG分析显示,有1411个预测的差异表达mi RNA靶基因,其中大多数由营养源摄取(Nutrition source uptake)、次级代谢、生长调节剂、植物生长素应答因子(Auxin response factor)、植物激素(Plant hormones)和脯氨酸代谢(Proline metabolism)等相关基因或转录因子编码基因,其中许多是应激反应基因。有趣的是,P.indica影响了mi RNA调控基因的差异丰度,以及与高温胁迫耐受性相关转录因子的表达量。此外,q RT-PCR验证结果表明,mi RNA测序数据的准确性很高,novel_mir11、mi R396、mi R159、mi R156、mi R172、mi R164和mi R171可能在P.indica影响下的香蕉耐热过程中起重要作用。