论文部分内容阅读
目的本研究以探讨结肠癌细胞在c-Met信号通路传导途径以及相关机制,为揭示肿瘤侵袭和转移的本质并为抗肿瘤的靶向治疗药物的临床应用提供理论依据。选用的c-Met特异性小分子抑制剂SU11274,探讨其对结肠癌细胞周期变化、增殖抑制作用机制及如何降低HGF刺激引起的c-Met磷酸化以及下游信号Ras及P13 K途径中关键分子Er、AkT、mTor和rpS6蛋白磷酸化水平,进而阻断其介导的细胞效应,从而发挥抑制c-Met激酶的作用。方法第一章节以33例结肠癌病理组织为研究对象,就c-Met在结肠癌相关的表达,对c-Met对结肠癌组织的作用以及其下游信号传导通路的表达,并应用免疫组化SP法对33例结肠癌组织进行c-Met及下游通路Er、Akt rpS6及mTor蛋白定位研究,进一步探讨c-Met信号及其下游传导信号在结肠癌组织的高表达及生物学意义。第二、三章节选用c-Met特异性小分子抑制剂SU1 1274为研究体系,分别将结肠癌细胞株k-ras野生型HT-29、Hct-8及k-ras突变型Hct-116、DLD-1作为研究对象,采用免疫印记、细胞增殖率、流式三种方法,观察选择性C-Met磷酸化抑制剂SU11274对体外培养的HT-29、Hct-8、Hct-116、DLD-1细胞增殖与周期变化的影响,检测了Met及下游Erk、Akt rpS6及mTor信号通路相关蛋白磷酸化水平变化,探讨选择性c-Met磷酸化抑制剂SU11274抗结肠癌细胞内信号传导机制及作用。本文第四章节联合应用c-Met磷酸化抑制剂SU 11274及Erk磷酸化抑制剂PD98059,以结肠癌细胞株中k-ras基因突变型Hct-116、DLD-1作为研究对象,采用免疫印记、细胞增殖率、流式三种方法,观察体外培养的k-ras基因突变型Hct-116、DLD-1细胞增殖与细胞周期的影响,检测了Met及下游Erk、Akt rpS6及mTor信号通路相关蛋白的变化,探讨联合用药抗结肠癌细胞内信号传导机制及作用。结果肿瘤组织免疫组化结果显示：c-Met在大肠癌中的阳性表达率为36.3%；Akt总阳性表达率为51.5%与c-Met共同出现阳性表达为11例其阳性表达率为91.7%; mTOR总阳性表达率为60.6%与c-Met共同出现阳性表达为10例其阳性表达率为83.3%；rpS6总阳性表达率为57.6%与c-Met共同出现阳性表达为11例其阳性表达率为91.7%；Erk总阳性表达率为51.5%与c-Met共同出现阳性表达为11例其阳性表达率为91.7%。SU11274对HT-29、HCT-8、Hct-116、DLD-1细胞增殖的抑制作用的结果发现,不同浓度的SU11274均对体外培养的HT-29、HCT-8、Hct-116、DLD-1四细胞系细胞有明显的增殖抑制作用,且这种作用有明显的剂量依赖性和时间依赖性,表现为细胞生长减慢和细胞集落形成率减少,即在浓度范围内,SU11274浓度越高,这种作用越明显。蛋白免疫印记结果表明：结肠癌细胞HT-29、Hct-8、Hct-116、DLD-1在刺激因子HGF作用下Met、Akt.、mTor、rpS6和Erk的磷酸化水平显著升高。低浓度的SU11274作用下Met的磷酸化几乎得到完全抑制,同时减弱了Akt、mTor、rpS6和Erk的磷酸化水平。细胞流式分析结果展示了SU11274作用下对结肠癌细胞HT-29、Hct-8、Hct-116、DLD-1生长周期变化的影响。具体表现为细胞GOG1期细胞比例明显增多,S期和G2M期细胞比例减少,细胞增殖阻滞于GOG1期,不能进入S期。结论一在结肠癌组织中存在和c-Met蛋白及下游信号通路的重要蛋白Akt、mTor、rpS6及Erk均出现的异常高表达,且c-Met蛋白的阳性表达与肿瘤的组织分型及TNM分期具有一定的相关性。二.HGF通过与其受体c-Met结合后,激活其信号传导通路,促进人结肠癌细胞株HT-29、Hct-8、Hct-116、DLD-1的细胞生长增殖;同时增强c-Met通路中Akt、mTor、rpS6及Erk的蛋白表达水平;增强细胞的体外侵袭能力。三.以c-Met为靶点,研发的小分子抑制剂SU11274对人结肠癌细胞株HT-29、Hct-8、Hct-116、DLD-1的细胞周期改变、细胞增殖抑制均有作用,同时存在对药物剂量、时间的依赖性,且对K-ras基因野生型HT-29、Hct-8细胞抑制效果明显优于K-ras基因突变型Hct-116、DLD-1细胞。四.以c-Met为靶点的SU11274及以MEK为靶点的PD98059联合给药,对人结肠癌K-ras基因突变型Hct-116、DLD-1细胞生长、增殖均有明显的抑制作用,其对细胞增殖抑制明显优于SU11274和PD98059单药作用。