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体细胞核移植(体细胞克隆)技术在医疗、农业及畜牧业等诸多领域有重要的应用价值,而克隆效率低和克隆动物发育异常严重阻碍了该技术的应用。供体核表观遗传修饰的不完全重编程是造成克隆效率低和克隆动物发育异常的主要原因。基因组印记是由等位基因表观遗传修饰的不对称导致的,其中DNA甲基化是调控印记的一种重要方式,许多印记基因上都有差异甲基化区(differentiallymethylatedregions,DMRs),因此,基因组印记和DNA甲基化是研究核移植过程中供体核重编程的重要内容。
Dlk1-Dio3印记区域在胚胎发育过程中起非常重要的作用,然而由于缺少基因序列以及多态性信息,Dlk1-Dio3区域在牛中印记的分子机制以及在体细胞核移植牛中的重编程还没有被研究。本研究在建立正常牛Dlk1-Dio3印记区域中Meg8(Maternallyexpressedgene8)基因及IG-DMR(theintergenic-DMR,)区域等位基因特异的DNA甲基化状态的基础上,分析其在体细胞核移植牛中的重编程,为揭示牛中Dlk1-Dio3区域印记的分子机制和寻找体细胞核移植牛发育异常的原因提供依据。
Meg8是位于Dlk1-Dio3印记区域内的一个母源表达的非编码蛋白的RNA基因。对Meg8基因序列分析发现,其5端没有显著的CpG岛,而在内含子3处存在一个CpG岛,为了确定该基因内部CpG岛的甲基化在调控Meg8基因印记中的可能作用,应用亚硫酸盐测序法对内含子3上CpG岛内的17个CpG位点等位基因特异的DNA甲基化状态进行了分析发现两条亲本链C链和T链的甲基化程度都比较高,但是T链甲基化程度还是显著高于C链的(P<0.05),并且结果显示C链的甲基化模式只有一种。对出生48小时死亡的体细胞核移植牛肺脏中Meg8基因内含子3的甲基化状态以及Meg8基因印记状态进行分析,结果发现Meg8基因内含子3处CpG岛的甲基化程度在正常牛和体细胞核移植牛中都比较高,但是体细胞核移植牛甲基化程度还是显著高于正常牛的甲基化程度(P<0.05),而且甲基化模式在体细胞核移植牛个体中发生明显变化,只有一种完全甲基化的模式,而Meg8基因在体细胞核移植牛个体中表达没有紊乱,仍表现为单等位基因表达,初步推测内含子3处CpG岛的甲基化没有参与调控Meg8基因的表达。
IG-DMR是Dlk1-Dio3印记区域上位于Dlk1和Gtl2基因间的差异甲基化区,被认为是Dlk1-Dio3印记区域真正的印记调控区(ICR),但其如何调控整个印记域的印记状态目前还不是很清楚。分析IG-DMR第一个CpG岛处9个CpG位点在自然繁殖牛染色体特异的甲基化状态,发现C链与G链的甲基化程度都很高(90.22％和87.00%),且差异不显著,说明这几个CpG位点的甲基化不参与印记调控;在体细胞核移植牛肺脏中C链甲基化水平(97.80%)显著高于G链(59.84%),且甲基化整体水平显著低于正常对照组,说明体细胞核移植牛中该区域DNA甲基化的重编程异常。